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第1章 背景1

1．1 引言1

1．2 关于第5版1

1．3 手册的目的2

第一部分 精液分析5

第2章 标准程序5

2．1 引言5

2．2 标本采集7

2．2．1 准备7

2．2．2 以诊断或研究为目的的精液采集8

2．2．3 用于辅助生殖的精液无菌采集8

2．2．4 用于微生物学分析的精液无菌采集8

2．2．5 在家采集精液9

2．2．6 使用避孕套采集精液9

2．2．7 标本的安全处理9

2．3 初步肉眼观察10

2．3．1 液化10

2．3．2 精液的黏稠度11

2．3．3 精液外观11

2．3．4 精液体积11

2．3．5 精液pH值12

2．4 显微镜初检13

2．4．1 精液充分混匀和代表性取样13

2．4．2 制备湿片13

2．4．3 精子聚集14

2．4．4 精子凝集15

2．4．5 非精子细胞成分16

2．5 精子活力16

2．5．1 精子运动分类17

2．5．2 制备和评估精液样本的精子活力17

2．5．3 样例19

2．5．4 参考值下限20

2．6 精子存活率20

2．6．1 应用伊红-苯胺黑的精子存活率试验20

2．6．2 单用伊红的精子存活率试验22

2．6．3 应用低渗膨胀的精子存活率试验23

2．7 精子数量25

2．7．1 计数板类型26

2．7．2 改良Neubauer血细胞计数板26

2．7．3 使用血细胞计数板网格27

2．7．4 计数板的保养28

2．7．5 稀释精液的固定液28

2．7．6 计数足够精子的重要性28

2．8 常规计数程序29

2．8．1 如何确定精液所需的稀释倍数29

2．8．2 稀释精液样本并加入血细胞计数板的计数池中31

2．8．3 评估计数池内的精子数目32

2．8．4 计算精液中精子浓度33

2．8．5 样例33

2．8．6 精子浓度的参考值下限34

2．8．7 计算每次射出精液的精子总数35

2．8．8 精子总数的参考值下限35

2．9 精子数目低的情况：隐匿精子症和可疑无精子症35

2．10 当精子数目少且无需进行精确计数时35

2．10．1 不做进一步处理35

2．10．2 离心样本后检测精子35

2．10．3 检测非离心标本中活动精子数目36

2．11 当精子数目少且需要准确评估时37

2．11．1 在整个改良Neubauer血细胞计数板计数池中评估精子数目少的样本（相差显微镜）38

2．11．2 用一次性大容量计数板计数精子少的样本（荧光显微镜）40

2．12 非精子细胞的计数方法44

2．12．1 计数精液中圆细胞浓度44

2．12．2 方法的灵敏度44

2．12．3 样例44

2．13 精子形态45

2．13．1 正常精子的概念45

2．13．2 精液涂片的制备46

2．14 染色方法49

2．14．1 传统的固定和染色方法49

2．14．2 用于精子形态学分析的巴氏染色程序49

2．14．3 用于精子形态学分析的Shorr染色程序51

2．14．4 精子形态的快速染色程序52

2．15 检查已染色的涂片53

2．15．1 正常精子形态学的分类53

2．15．2 异常精子形态学的分类54

2．16 形态学彩图55

2．17 精子形态学涂片的分析84

2．17．1 正常精子形态的评估84

2．17．2 样例85

2．17．3 参考值下限85

2．17．4 异常精子形态的评估85

2．17．5 样例86

2．17．6 特定精子缺陷的评估86

2．18 精液中白细胞的评估87

2．18．1 使用邻甲苯胺染细胞内过氧化物酶的步骤87

2．19 精液中未成熟生殖细胞的评估91

2．20 精子包被抗体的检测91

2．20．1 混合抗球蛋白反应试验92

2．20．2 直接免疫珠试验94

2．20．3 间接免疫珠试验96

第3章 可供选择的方案98

3．1 多重精子缺陷指数98

3．1．1 多重形态缺陷指数的计算98

3．1．2 样例98

3．2 全白细胞（CD45）免疫细胞化学染色100

3．2．1 原理100

3．2．2 试剂100

3．2．3 步骤101

3．3 精子-宫颈黏液的相互作用103

3．3．1 体内试验（性交后试验）103

3．3．2 体外试验106

3．3．3 体外简化玻片试验107

3．3．4 毛细管试验108

3．4 附属性器官功能的生化测试110

3．4．1 精浆锌的测定110

3．4．2 精浆果糖的测定112

3．4．3 精浆中性α-葡糖苷酶的测定113

3．5 计算机辅助精子分析115

3．5．1 引言115

3．5．2 使用CASA评估精子的活力116

3．5．3 CASA用于评估精子浓度118

3．5．4 计算机辅助精子形态学计量分析118

第4章 用于研究的方法120

4．1 活性氧（reactive oxygen species，ROS）120

4．1．1 引言120

4．1．2 精子悬液活性氧的检测121

4．2 人精子-卵母细胞相互作用试验123

4．3 人卵透明带结合试验124

4．4 顶体反应检测124

4．4．1 顶体状态荧光检测方法的操作步骤124

4．4．2 诱导顶体反应的检测126

4．5 去透明带仓鼠卵穿透试验128

4．5．1 方案128

4．6 精子染色质的检测132

第二部分 精子制备135

第5章 精子制备技术135

5．1 引言135

5．1．1 精子从精浆中的分离135

5．1．2 制备方法的选择135

5．1．3 将精子与精浆和感染性微生物分离的效率136

5．2 总则136

5．3 简单的洗涤136

5．3．1 试剂136

5．3．2 程序137

5．4 直接上游法137

5．4．1 试剂137

5．4．2 程序137

5．5 非连续密度梯度法138

5．5．1 试剂138

5．5．2 程序139

5．6 HIV感染精液标本的制备139

5．7 睾丸和附睾精子的制备139

5．7．1 酶学方法140

5．7．2 机械方法140

5．7．3 处理精子悬液用于ICSI140

5．8 逆行射精标本的制备140

5．9 辅助射精标本的制备141

第6章 精子的冷冻保存142

6．1 引言142

6．2 精液冷冻保存方案144

6．2．1 标准程序144

6．2．2 少精子症标本和手术取精的冷冻方案146

6．2．3 麦管的标记和记录147

第三部分 质量保证151

第7章 质量保证和质量控制151

7．1 男科学实验室的质量控制151

7．2 精液分析中误差的性质151

7．3 减小统计学抽样误差153

7．4 质量保证项目153

7．5 实验室操作手册153

7．6 内部质量控制154

7．6．1 外购的QC样本154

7．6．2 实验室自制的QC样本154

7．6．3 储存的QC样本（外购或自制）154

7．6．4 新鲜的QC样本（实验室自制）155

7．7 分析和报告检测人员自身和之间的系统误差的统计学程序156

7．7．1 Xbar图156

7．7．2 S图157

7．8 百分率的质控159

7．9 评价Xbar和S图159

7．9．1 如何识别失控值159

7．9．2 失控的原因160

7．9．3 对失控值的回应160

7．10 分析和报告检测人员间差异的统计学程序161

7．10．1 两个或两个以上检测人员之间结果比较161

7．10．2 月均值的监控164

7．11 外部质量控制和质量保证164

7．11．1 EQC结果的评估165

7．11．2 对失控结果的回应165

7．12 QC的频率和优先考虑165

7．13 培训166

7．13．1 分析精子浓度遇到问题时的实用建议166

7．13．2 精子形态学分析遇到问题时的实用建议167

7．13．3 精子活力分析遇到问题时的实用建议168

7．13．4 精子存活率分析遇到问题时的实用建议169

参考文献171

附录191

附录1 参考值和精液术语191

A1．1 参考值191

A1．2 术语193

附录2 设备与安全195

A2．1 男科学实验室需的基本配置195

A2．2 男科学实验室的潜在生物危害197

A2．3 实验室人员的安全操作规程197

A2．4 实验室仪器的安全使用规程199

A2．5 操作液氮时的安全措施199

附录3 显微镜的使用201

A3．1 加样201

A3．2 调整目镜位置202

A3．3 图像聚焦202

A3．4 目镜聚焦203

A3．5 调光源聚光器的焦距203

A3．6 校正聚光器中心203

A3．7 相位环的调节204

A3．8 荧光显微镜204

附录4 储备溶液205

A4．1 Biggers,Whitten和Whittingham205

A4．2 Dulbeccos磷酸盐缓冲液205

A4．3 Earle'S培养液206

A4．4 Ham's F-10培养液206

A4．5 Hanks'平衡盐溶液206

A4．6 人类输卵管液207

A4．7 Krebs-Ringer培养基207

A4．8 Tris缓冲液207

A4．9 Tyrode's溶液208

A4．10 Papanicolaou染色液208

附录5 宫颈黏液211

A5．1 引言211

A5．2 宫颈黏液的采集和保存212

A5．3 宫颈黏液的评估212

附录6 精液和宫颈黏液分析记录表格216

A6．1 精液分析记录表格模板216

A6．2 宫颈黏液记录表格模板218

附录7 抽样误差和质量控制219

A7．1 精子浓度测定中的误差219

A7．2 了解抽样误差的重要性220

A7．3 百分率测定中的误差221

A7．4 用于质量控制的精液样本制备224

A7．5 制作视频录像用于精子活力分析的内部质量控制224

A7．6 制备稀释精液用于评估精子浓度的内部质量控制228

A7．7 精子形态学评估内部质量控制涂片的制备230

A7．8 设备校准231

附录8 精液分析的国家外部质量控制项目233

图6

图2-1 在1年半期间精子总数和精子浓度的变异6

图2-2 精液中精子的非特异性聚集14

图2-3 精子不同凝集程度的示意图15

图2-4 辅助评估精子活力18

图2-5 在亮视野显微镜下观察伊红-苯胺黑涂片22

图2-6 人精子在低渗透压作用下的特征性形态变化的示意图24

图2-7 改良Neubauer血细胞计数板26

图2-8 网格中方格的精子计数27

图2-9 观察整个盖玻片区域寻找活动精子37

图2-10 “正常”形态精子45

图2-11 用于精子形态学分析的精液涂片方法47

图2-12 制备一张正常精液的涂片47

图2-13 人精子一些异常形态的示意图55

图2-14 人精液中过氧化物酶阳性与阴性细胞88

图3-1 精液中的白细胞102

图3-2 Kremer精子穿透计108

图3-3 CASA系统检测参数的标准术语117

图4-1 酵母多糖刺激白细胞产生的化学发光信号122

图4-2 细胞悬液中白细胞和精子的活性氧产生的相对量123

图4-3 人精子豌豆凝集素（PSA）荧光染色126

图4-4 含有人精子的去卵透明带仓鼠卵母细胞的相差显微镜照片132

图7-1 精子浓度的Xbar图158

图7-2 精子浓度S图159

图7-3 前向运动精子百分率的人工和CASA测量值Bland-Altman图161

图7-4 精子浓度测量值Youden图162

图A2-1 根据转子半径和转速测定相对离心力（RCF）的列线图198

图A5-1 玻片上干燥的宫颈黏液羊齿状结晶形成示例211

图A7-1 根据评估的精子总数得出的两次重复计数之间的可接受差异220

图A7-2 对应于真实百分率和所测精子总数的两次重复测量所得百分率之间的可接受差异222

图A7-3 辅助评估精子活力226

图A7-4 通过带有网线（红色栅格）的目镜观察227

图A7-5 监视器上显示的镜台测微尺录像和覆盖在监视器上的绘制栅格，说明见文内228

方框8

方框2-1 证实精液采集容器的相容性8

方框2-2 菠萝蛋白酶的准备11

方框2-3 充分混匀精液14

方框2-4 制备湿片的深度14

方框2-5 评估百分率的误差19

方框2-6 重复百分率的比较19

方框2-7 评估精子数目的误差28

方框2-8 在改良Neubauer血细胞计数池的中央3个网格对每个重复样本计数200个精子29

方框2-9 20μm深的湿片，每高倍镜视野所观察的精液体积30

方框2-10 重复计数的比较33

方框2-11 每个样本在改良Neubauer血细胞计数板的全部9个网格计数达到200个精子38

方框2-12 在100μm深的大容量一次性计数板上，每个重复样本可计数达到200个精子41

方框2-13 在100μm深的大容量一次性计数板上，每高倍镜视野观察到的体积42

方框2-14 封片剂49

方框3-1 蜡-凡士林混合物的制备104

方框3-2 在制备的100μm厚度黏液玻片中每个高倍视野所观察的体积105

方框4-1 诱发仓鼠排卵129

方框4-2 制备玻璃移液管131

方框6-1 精液冷冻保存的原因143

方框6-2 人精液冷冻保存的风险评估144

方框7-1 质量保证和质量控制术语152

方框7-2 确定XBar图的警戒限和处置限157

方框7-3 计算XBar控制限的另一方法：由合并标准差计算157

方框7-4 确定S图的警戒限和处置限158

方框7-5 质控图的基本控制规则160

方框7-6 评估检测人员之间的系统性差异163

方框7-7 IQC的主要特性164

方框7-8 QC日程表166

方框7-9 QC检验概要166

方框A2-1 离心力的计算197

方框A3-1 物镜202

方框A5-1 测定采集到的宫颈黏液体积213

方框A5-2 厚度100μm的黏液制片每高倍视野的体积214

表19

表2-1 从重复计数200个精子（总共计数400个精子）确定所给出平均值的两个百分率之间的可接受差异19

表2-2 根据计数的精子总数四舍五入的取样误差（％）29

表2-3 精液标本所需的稀释倍数，如何进行稀释，使用的计数板和可能评估的区域30

表2-4 对于一定总数的两个重复计数可接受的差异32

表2-5 对于一定总数的两次计数之间可接受的差异：低精子浓度39

表2-6 精子形态学彩图中注释的解释56

表2-7 用于免疫珠试验的精液量94

表3-1 多重精子缺陷指数的计算99

表3-2 生育和不育夫妇中男性的精子缺陷指数99

表3-3 精子穿透密度的等级顺序109

表3-4 毛细管试验结果的分级109

表7-1 XBar图和基于平均标准差（XBar）的S图的控制限的决定因素156

表7-2 精子浓度分析时变异（误差）的来源和建议的解决方案167

表7-3 精子形态学分析时变异（误差）的来源和推荐的解决方案168

表7-4 精子活力分析时变异（误差）的来源和建议的解决方案168

表7-5 精子存活率分析时变异（误差）的来源和推荐的解决方案169

表A1-1 精液特性的参考值下限（第5个百分位数，95％可信区间）192

表A1-2 源自性伴侣在停止使用避孕措施后12个月内怀孕的男性精液参数值的分布192

表A1-3 与精液质量相关的术语193

表A7-1 对应于特定总数的两次重复计数之间的可接受差异220

表A7-2 对应于重复计数100个（总共200个）精子所得到的平均百分率，两次评估值之间的可接受差异223

表A7-3 对应于重复计数200个（总共400个）精子所得到的平均百分率，两次评估值之间的可接受差异223

表A7-4 对应于重复计数400个（总共800个）精子所得到的平均百分率，两次评估值之间的可接受差异224