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第一篇 乳酸细菌的分类鉴定3

第一章 乳酸细菌的分类及有关属的特性3

第一节 乳酸细菌的定义及其范围3

一、乳酸细菌的定义3

二、乳酸细菌范围的界定3

三、乳酸细菌有关的属4

第二节 乳酸细菌的分类位置5

一、伯杰氏细菌分类系统5

二、乳酸细菌分类近史6

三、乳酸细菌在细菌系统中的位置7

第三节 乳酸细菌有关属类群的划分9

一、乳杆菌属及其有关属9

二、肠球菌属及其有关属10

三、双歧杆菌属及其有关属10

四、芽孢杆菌和梭菌的有关属10

五、近年报道的且尚未编入《伯杰氏系统细菌学手册》第二版的新属10

第四节 乳杆菌属和有关属及其特性10

一、乳杆菌属10

二、类乳杆菌属19

三、片球菌属20

四、气球菌属20

五、营养缺陷菌属21

六、肉食杆菌属21

七、碱杆菌属22

八、德瑟兹氏菌属22

九、棍状菌属23

十、海生乳杆菌属23

十一、毛发球菌属23

十二、明串珠菌属24

十三、酒球菌属25

十四、魏斯氏菌属26

第五节 肠球菌属和有关属及其特性26

一、肠球菌属26

二、蜜蜂球菌属28

三、四联球菌属29

四、漫游球菌属29

五、链球菌属29

六、乳球菌属31

七、乳卵形菌属32

第六节 双歧杆菌属和有关属及其特性33

一、双歧杆菌属33

二、斯氏菌属37

三、类斯氏菌属38

四、气斯氏菌属39

五、异斯氏菌属39

六、另类斯氏菌属39

七、奇异菌属39

八、欧鲁森氏菌属40

第七节 芽孢杆菌和梭菌有关的属40

一、芽孢杆菌属（Bacillus）内属于乳酸细菌的种40

二、嗜盐乳杆菌属42

三、糖球菌属42

四、利斯特氏菌属43

五、环丝菌属43

六、芽孢乳杆菌属44

七、孪生球菌属45

八、毛形杆菌属45

第八节 近年报道的乳酸细菌新属45

一、矛形细菌属46

二、嗜果糖乳酸细菌属46

三、夏普氏菌属47

四、产乳酸细菌属47

第二章 乳酸细菌的分离和培养51

第一节 选择分离和培养方法的原则51

一、乳酸细菌在自然界的生存区域和生活环境51

二、必需的营养组分51

三、对氧的要求52

四、适宜的生长温度和pH范围52

第二节 乳杆菌属的分离和培养52

一、半选择性培养基53

二、选择性培养基54

三、不同生境乳杆菌分离的培养基54

四、培养的气态环境和温度57

第三节 肉食杆菌的分离和培养57

一、半选择性D-MRS培养基57

二、甲酚红乙酸铊蔗糖（CTAS）培养基58

三、湖底肉食杆菌和水底肉食杆菌的分离和培养58

四、永冻层肉食杆菌的分离和培养59

第四节 明串珠菌的分离和培养59

一、半选择性培养基60

二、选择性培养基61

第五节 酒球菌的分离和培养61

一、酸性番茄培养基（ATB培养基）62

二、果糖吐温80培养基（FT培养基）62

三、葡萄汁培养液62

第六节 芽孢乳杆菌的分离和培养62

一、纳亚氏分离法63

二、东韦氏分离法63

三、芽孢乳杆菌的培养64

第七节 肠球菌的分离和培养65

一、TTC叠氮化钠培养基（g/L）65

二、卡那霉素七叶灵培养基65

三、Proteose蛋白胨甘油磷酸钠培养基——KF培养基（g/L）66

第八节 链球菌的分离和培养66

一、适用于链球菌样品转移的培养基66

二、分离链球菌选择性的培养基66

三、链球菌的培养67

第九节 乳球菌的分离和培养68

一、富集和分离69

二、乳球菌的分离培养基69

第十节 双歧杆菌的分离和培养70

一、样品的收集和制备70

二、双歧杆菌的分离培养技术72

三、双歧杆菌培养基76

第三章 乳酸细菌的分类鉴定方法80

第一节 乳酸细菌的分类鉴定特征及其类别80

第二节 生化特征测定方法80

一、概述80

二、氧化酶的测定82

三、过氧化氢酶的测定83

四、从葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气83

五、碳水化合物发酵产酸实验84

六、淀粉水解86

七、石蕊牛奶87

八、明胶液化实验87

九、七叶灵水解88

十、乙酰甲基甲醇实验（V-P实验）88

十一、硫化氢的产生89

十二、马尿酸盐的水解90

十三、精氨酸产氨实验91

十四、精氨酸水解实验92

十五、葡聚糖的产生92

十六、溶血反应实验93

十七、脲酶的测定93

十八、吡咯烷芳基酰胺酶（PYR）的测定94

十九、果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）实验95

二十、气相色谱测定乳酸及短链脂肪酸的分析法95

第三节 乳酸细菌化学分类特征的测定分析方法98

一、乳酸旋光度的化学测定法98

二、醌的分析方法100

三、细胞脂肪酸测定法102

四、细菌细胞壁的组分及分析方法103

第四节 基因型和系统发育型特征的实验方法107

一、DNA的G+C含量测定107

二、DNA-DNA分子杂交方法111

三、用PCR-ELISA反应的鉴定方法116

四、用全基因组DNA脉冲场凝胶电泳的鉴定方法118

五、16S rDNA序列同源性的鉴定方法120

六、用基因组DNA扩增片段长度多态性的鉴定方法122

七、16S rRNA序列分析方法和系统进化树的构建124

第二篇 乳酸细菌发挥生理功能的物质基础131

第四章 乳酸细菌细胞壁成分的分离和纯化131

第一节 荚膜多糖的分离和纯化131

一、原理131

二、材料131

三、方法和步骤131

四、注意事项132

第二节 脂磷壁酸的分离和纯化133

一、原理133

二、材料133

三、方法和步骤133

四、注意事项134

第三节 肽聚糖的分离和纯化134

一、原理134

二、材料135

三、方法和步骤135

四、注意事项136

第五章 乳酸细菌产生的糖类物质137

第一节 产生胞外多糖的菌株和培养基137

一、产胞外多糖乳酸细菌的分离、筛选137

二、产胞外多糖的菌株和培养基140

第二节 胞外多糖的测定方法143

一、硫酸-苯酚法测定多糖合成量144

二、干燥称重法145

三、高效液相色谱法（HPLC法）146

四、硫酸-蒽酮法147

第三节 多糖的分离和纯化148

一、概述148

二、德氏乳杆菌保加利亚亚种胞外多糖的分离和纯化150

三、嗜热链球菌胞外多糖的分离和纯化154

四、复合糖的分离和纯化156

第六章 乳酸细菌产生的抗菌物质160

第一节 过氧化氢的定量分析160

一、滴定法——高锰酸钾氧化法160

二、分光光度法——辣根过氧化物酶法161

第二节 细菌素的抑菌活性和效价测定方法163

一、细菌素抑菌活性的测定方法163

二、管碟法测定细菌素的效价167

第三节 产细菌素乳酸细菌的筛选170

一、细菌素产生菌的筛选170

二、产乳链菌肽菌的筛选（一）172

三、产乳链菌肽菌的筛选（二）173

第四节 细菌素的分离和纯化176

一、吸附法初步纯化细菌素176

二、植物乳杆菌KLDS 1.0391所产细菌素的分离和纯化178

三、副干酪乳杆菌J23所产广谱抗菌肽Bac-J23的分离纯化180

四、嗜酸乳杆菌NX2-6所产抑菌物质的分离纯化181

第五节 苯乳酸、4-羟基苯乳酸和苯乙酸的定性定量分析184

一、反相高效液相色谱法分析苯乳酸和4-羟基苯乳酸184

二、GC-MS法分析苯乳酸和4-羟基苯乳酸186

三、苯乙酸的定性定量分析187

第六节3-羟基丙醛（3-HPA）产生菌的筛选和定性定量分析189

一、原理189

二、材料190

三、方法和步骤190

四、注意事项191

第七章 乳酸细菌产生的其他生理活性物质192

第一节 γ-氨基丁酸的定性定量分析192

一、定性方法——平面色谱法192

二、定量方法——HPLC194

第二节 精氨酸脱亚胺酶的活性测定195

一、原理195

二、材料196

三、方法和步骤196

四、注意事项197

第三节 血管紧张素转化酶抑制剂的检测197

一、具有血管紧张素转化酶抑制活性的菌株的筛选197

二、乳源降血压肽的制备工艺200

三、血管紧张素转化酶抑制剂的定性定量分析202

第四节 叶酸的定性定量分析204

一、原理204

二、材料205

三、方法和步骤206

四、注意事项208

第五节 维生素B12的定性定量分析209

一、定性鉴别209

二、定量测定209

第六节 胆汁盐水解酶的活性测定211

一、原理211

二、材料211

三、方法和步骤211

第七节 透明质酸的定性定量分析213

一、原理213

二、材料213

三、方法和步骤213

四、注意事项214

第八节 共轭亚油酸的定性定量分析215

一、共轭亚油酸高产乳酸细菌的筛选215

二、共轭亚油酸的定性定量分析217

第三篇 乳酸细菌在食品、保健品和动物饲料中的应用223

第八章 乳酸细菌产生的风味物质223

第一节 乙醛和双乙酰（丁二酮）的定性定量分析223

一、乙醛和双乙酰的提取223

二、乙醛和双乙酰的定量分析227

第二节 支链氨基酸的分析232

一、纸层析-色斑洗脱比色法233

二、高效液相色谱法235

三、毛细管电泳238

第九章 乳酸细菌发酵食品241

第一节 乳酸细菌直投式发酵剂的制备241

一、原理241

二、材料241

三、方法和步骤242

四、注意事项243

第二节 发酵酸奶的实验243

一、原理243

二、材料244

三、方法和步骤245

四、注意事项246

第三节 发酵乳清型多肽饮料的制备工艺247

一、原理247

二、材料247

三、方法和步骤248

四、注意事项249

第四节 筛选发酵大豆食品的优良菌种249

一、原理249

二、材料250

三、发酵参数250

四、分析方法250

第五节 发酵奶酪的实验251

一、Cheddar于酪的制备工艺251

二、Mozzarella干酪的制备工艺252

第六节 人工发酵泡菜255

一、原理255

二、材料256

三、方法与步骤256

四、注意事项257

第七节 发酵香肠的实验257

一、原理257

二、材料258

三、方法与步骤258

四、注意事项259

第十章 乳酸细菌微生态制剂的制备261

第一节 高密度培养261

一、补料分批培养261

二、细胞循环培养263

第二节 粉末制剂的制备265

一、真空冷冻干燥法265

二、喷雾干燥法267

第三节 益生菌片的制备269

一、原理269

二、材料269

三、方法和步骤270

四、注意事项271

第四节 乳酸细菌微胶囊的制备272

一、基于海藻酸钠的益生菌微胶囊的制备272

二、空气悬浮法制备益生菌微胶囊275

第十一章 动物用益生菌剂和青贮饲料发酵剂279

第一节 动物用益生菌剂279

一、芽孢杆菌益生菌剂280

二、乳酸细菌益生菌剂282

第二节 青贮饲料用的发酵剂285

一、饲料作物及牧草上自然分布的乳酸细菌285

二、青贮发酵实验法与乳酸细菌的分离286

三、快速初筛选青贮饲料优良乳酸细菌288

四、稻茎秸秆和未利用资源的乳酸细菌的开发与利用289

五、青贮饲料发酵剂的制备292

第四篇 乳酸细菌在疾病防治和保健中的应用297

第十二章 乳酸细菌解毒和分解致癌物质297

第一节 清除自由基活性的检测297

一、原理297

二、材料297

三、方法和步骤298

四、注意事项298

第二节 降解生物胺的实验299

一、原理299

二、材料299

三、方法和步骤300

四、注意事项301

第三节 分解亚硝酸盐的实验302

一、原理302

二、材料302

三、方法和步骤302

四、注意事项303

第四节 降解黄曲霉毒素的实验304

一、原理304

二、材料304

三、方法和步骤304

四、注意事项306

第五节 降低重金属铅毒害的实验306

一、原理306

二、材料307

三、方法和步骤307

第六节 利用高效液相色谱法检测乳酸细菌脱基因毒性功能308

一、原理308

二、材料308

三、方法和步骤309

四、数据处理310

五、注意事项310

第十三章 乳酸细菌耐酸、耐胆汁和抗胁迫反应312

第一节 耐酸、耐胆盐乳酸细菌菌株的分离与筛选312

一、原理312

二、材料312

三、方法和步骤313

四、注意事项313

第二节 乳酸细菌抗氧化活性的测定方法314

一、原理314

二、材料315

三、方法和步骤315

四、注意事项317

第三节 抗高温胁迫的实验318

一、原理318

二、材料318

三、方法和步骤319

四、注意事项319

第四节 抗渗透压胁迫的实验320

一、原理320

二、材料320

三、方法和步骤320

四、注意事项321

第十四章 乳酸细菌的免疫功能与延缓衰老322

第一节 宿主细胞的培养322

一、原理322

二、材料322

三、方法和步骤322

四、注意事项322

第二节 宿主细胞的传代和保存323

一、原理323

二、材料323

三、方法和步骤324

四、注意事项324

第三节 黏附实验325

一、乳酸细菌细胞疏水性测定325

二、乳酸细菌的黏附性测定326

三、黏附性双歧杆菌菌株的筛选327

四、不同细菌对细胞竞争性黏附330

第四节 胞外多糖和脂磷壁酸的免疫调节作用331

一、原理331

二、材料332

三、方法和步骤332

四、注意事项334

第五节 乳酸细菌对T淋巴细胞亚群的影响334

一、原理334

二、材料335

三、方法和步骤335

四、注意事项336

第六节 乳酸细菌对血清抗体的影响337

一、原理337

二、材料337

三、方法和步骤338

四、注意事项338

第七节 乳酸细菌对黏膜抗体的影响339

一、原理339

二、材料339

三、方法和步骤340

四、注意事项340

第八节 利用秀丽隐杆线虫评价乳酸细菌延缓衰老的功能341

一、原理341

二、材料341

三、方法和步骤342

四、注意事项345

第五篇 乳酸细菌在工业上的应用349

第十五章D-乳酸和L-乳酸的分析349

第一节L-乳酸的检测349

一、酶法测定L-乳酸349

二、高效液相色谱法测定L-乳酸351

第二节D-乳酸的检测353

一、酶法测定D-乳酸353

二、HPLC法测定D-乳酸354

第十六章 乳酸细菌发酵生产乳酸工艺356

第一节 以葡萄糖为原料生产L-乳酸工艺356

一、原理356

二、材料357

三、方法和步骤357

四、注意事项358

第二节 以纤维素为原料生产L-乳酸工艺359

一、原理359

二、材料359

三、方法和步骤359

四、注意事项361

第三节 以淀粉质为原料生产L-乳酸工艺361

一、原理361

二、材料361

三、方法和步骤362

四、注意事项363

第四节 以花生粕为原料生产D-乳酸工艺363

一、原理363

二、材料363

三、方法和步骤364

四、注意事项365

第十七章 发酵产品中乳酸细菌的快速检测技术366

第一节 发酵产品中乳酸细菌的快速计数方法366

一、纸片法366

二、电阻抗法367

第二节 发酵产品中乳酸细菌的快速鉴定方法368

一、实时荧光PCR法368

二、变性高效液相色谱法369

第十八章 产甘露醇和多糖水解酶菌的筛选372

第一节 乳酸细菌发酵液中甘露醇的分析检测方法372

一、薄层层析法分析发酵体系中的甘露醇373

二、分光光度法分析发酵体系中的甘露醇374

三、高效液相色谱法分析发酵体系中的甘露醇377

第二节 产甘露醇乳酸细菌的筛选378

一、产甘露醇乳酸细菌的初步筛选378

二、产甘露醇乳酸细菌的复筛378

第三节 多糖水解酶菌的筛选378

一、原理378

二、材料379

三、方法和步骤379

四、注意事项380

第十九章 乳酸细菌噬菌体的检测、分离纯化和防治381

第一节 检测噬菌体的方法381

一、原理381

二、实验材料381

三、实验方法381

第二节 噬菌体的分离和纯化382

一、原理382

二、实验材料383

三、实验步骤383

第三节 噬菌体的防治384

一、注重环境卫生384

二、完善发酵工艺385

三、生产菌株的轮番使用385

四、噬菌体抗性菌株的选育385

第六篇 乳酸细菌安全性评估方法389

第二十章 乳酸细菌对抗菌药物的敏感性389

第一节 细菌耐药性表型检测389

一、琼脂稀释法389

二、K-B纸片琼脂扩散法392

三、E-test法393

第二节 细菌耐药基因的检测395

一、DNA探针法检测耐药基因（以β-内酰胺酶基因为例）395

二、PCR方法检测耐药基因（以检测红霉素耐药基因为例）397

第二十一章 乳酸细菌有害酶及代谢产物的检测404

第一节 硝基还原酶活性检测404

一、定性检测404

二、定量检测405

第二节 偶氮还原酶活性检测406

一、定性检测407

二、定量检测408

第三节D-乳酸含量检测409

一、原理409

二、材料409

三、方法和步骤409

四、注意事项410

第四节 β-葡萄糖苷酶活性检测410

一、原理410

二、材料410

三、方法和步骤411

四、注意事项411

第五节 β-葡萄糖醛酸苷酶活性检测411

一、原理411

二、材料412

三、方法和步骤412

四、注意事项412

第六节 生物胺含量检测413

一、产生物胺能力的定性检测413

二、产生生物胺能力的定量检测——丹酰衍生物的RP-HPLC检测法414

第二十二章 基于基因组学的乳酸细菌安全性评价417

第一节 菌株的全基因组测序417

一、原理417

二、材料418

三、方法和步骤418

四、注意事项421

第二节 基于全基因组的安全性相关信息分析421

一、原理421

二、材料422

三、方法和步骤422

四、注意事项423

第七篇 乳酸细菌的遗传与变异427

第二十三章 乳酸细菌DNA的提取和纯化427

第一节 染色DNA的分离和纯化427

一、原理427

二、材料427

三、方法和步骤428

四、注意事项430

第二节 乳酸乳球菌质粒DNA的提取430

一、方法一430

二、方法二432

第三节 噬菌体DNA的提取433

一、原理433

二、材料434

三、方法和步骤435

四、注意事项436

第四节RNA与DNA共提取437

一、原理437

二、材料437

三、方法和步骤437

四、注意事项439

第二十四章 乳酸细菌中基因导入和敲除的方法440

第一节 乳酸细菌基因组洗牌重组440

一、原理440

二、材料和试剂440

三、方法和步骤441

四、技术优点441

第二节 乳酸细菌感受态细胞的制备和电转化442

一、乳酸乳球菌感受态细胞的制备和电转化442

二、链球菌感受态细胞的制备和电转化446

三、肠球菌感受态细胞的制备和电转化452

四、乳杆菌感受态细胞的制备和转化456

五、双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化464

第三节 乳酸细菌的基因敲除468

一、方法一468

二、方法二469

第二十五章 细菌素生物合成中功能基因的克隆及作用机制分析475

第一节 乳链菌肽启动子的诱导表达475

一、原理475

二、材料475

三、方法和步骤476

第二节 乳链菌肽抗性基因的筛选及鉴定477

一、原理477

二、材料478

三、方法和步骤478

四、注意事项479

第三节 乳链菌肽抗性基因作用机制分析480

一、原理480

二、材料480

三、方法和步骤481

四、注意事项482

第四节 羊毛硫细菌素的半体外生物合成482

一、原理482

二、材料483

三、方法和步骤483

四、注意事项484

第五节 细菌素生物合成基因簇的克隆及功能分析484

一、原理484

二、材料484

三、方法和步骤485

四、注意事项486

第六节 细菌素作用机制的分析——孔洞形成能力表征486

一、原理486

二、材料486

三、方法和步骤487

四、注意事项487

第二十六章 乳酸细菌菌种的保藏和防止退化变异488

第一节 细菌菌种退化和变异是普遍现象488

一、引起菌种退化和变异的物质基础488

二、引起退化和变异的原因489

三、防止菌种退化和变异的措施489

第二节 定期移植保藏法490

一、原理490

二、培养基490

三、方法和步骤490

四、注意事项491

第三节 冷冻干燥法492

一、原理492

二、材料492

三、方法和步骤492

第四节 液氮超低温冻结保藏法493

一、原理493

二、材料493

三、方法与步骤494

第五节 超低温冻结法保藏494

一、原理494

二、材料495

三、方法和步骤495

附录 常用培养基组分497