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第一章 基因工程概述1

第一节 基因操作与基因工程1

一、基因操作与基因工程的关系1

二、基因工程的诞生与发展2

第二节 基因工程是生物科学发展的必然产物4

一、基因是基因重组的物质基础4

二、DNA的结构和功能5

三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展7

四、基因工程的内容9

第三节 基因的结构——基因操作的理论基础10

一、基因的结构组成对基因操作的影响10

二、基因克隆的通用策略11

思考题12

主要参考文献12

第一篇 基因操作原理17

第二章 分子克隆工具酶17

第一节 限制性内切酶17

一、限制与修饰17

二、限制酶识别的序列20

三、限制酶产生的末端21

四、DNA末端长度对限制酶切割的影响25

五、位点偏爱26

六、酶切反应条件27

七、星星活性28

八、单链DNA的切割29

九、酶切位点的引入29

十、影响酶活性的因素29

十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性30

第二节 甲基化酶30

一、甲基化酶的种类30

二、依赖于甲基化的限制系统31

三、甲基化对限制酶切的影响31

第三节 DNA聚合酶32

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ32

二、Klenow DNA聚合酶33

三、T4噬菌体DNA聚合酶34

四、T7噬菌体DNA聚合酶34

五、耐热DNA聚合酶34

六、反转录酶34

七、末端转移酶35

第四节 其他分子克隆工具酶35

一、依赖于DNA的RNA聚合酶35

二、连接酶36

三、T4多核苷酸激酶37

四、碱性磷酸酶37

五、核酸酶37

六、核酸酶抑制剂39

七、琼脂糖酶39

八、DNA结合蛋白39

九、其他酶39

思考题40

主要参考文献40

第三章 分子克隆载体41

第一节 质粒载体41

一、质粒的基本特性41

二、标记基因43

三、质粒载体的种类45

第二节 λ噬菌体载体48

一、λ噬菌体的分子生物学48

二、λ噬菌体载体的选择标记53

三、代表性λ噬菌体载体54

四、λ噬菌体载体的克隆原理及步骤59

五、λ噬菌体位点特异性重组系统在基因克隆中的应用62

第三节 单链丝状噬菌体载体63

一、M13噬菌体的生物学64

二、M13噬菌体载体65

三、M13噬菌体载体的宿主菌67

四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题70

五、噬菌粒71

六、M13KO7辅助噬菌体71

思考题72

主要参考文献72

第四章 人工染色体载体74

第一节 黏粒载体75

一、黏粒的结构特征和用途75

二、黏粒载体的工作原理75

三、黏粒克隆载体77

四、黏粒文库的扩增和贮存78

五、构建黏粒文库应注意的问题79

第二节 酵母人工染色体载体80

一、YAC载体的复制元件和标记基因80

二、YAC载体的工作原理81

第三节 细菌人工染色体载体82

一、BAC载体及其结构组成83

二、BAC载体工作原理83

三、控制拷贝数的BAC载体和Fosmid载体84

第四节 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体84

一、P1噬菌体的分子遗传特征85

二、P1噬菌体载体86

三、P1人工染色体载体87

思考题89

主要参考文献89

第五章 表达载体90

第一节 大肠杆菌表达载体90

一、大肠杆菌表达载体的结构90

二、利用T7噬菌体启动子的表达载体92

三、利用大肠杆菌固有基因启动子的表达载体94

四、表达融合蛋白的表达载体95

五、无细胞体系蛋白质表达系统99

六、表达产物的纯化100

七、蛋白表达中可能存在的问题101

第二节 穿梭载体102

一、大肠杆菌／革兰氏阳性细菌穿梭载体103

二、大肠杆菌／酵母菌穿梭载体103

三、其他穿梭载体104

第三节 整合载体104

一、基因插入／基因敲除104

二、随机插入突变载体105

思考题108

主要参考文献108

第六章 基因操作中大分子的分离和检测109

第一节 DNA的分离、检测和纯化109

一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化109

二、基因组DNA的分离110

三、DNA的琼脂糖凝胶电泳112

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳113

五、脉冲场凝胶电泳113

六、紫外吸收法检测DNA的浓度和纯度114

七、DNA片段的纯化115

第二节 RNA的分离、检测和纯化116

一、控制潜在RNA酶的活性116

二、RNA的抽提和纯化116

三、mRNA的纯化117

四、RNA的电泳检测117

第三节 分子杂交118

一、Southern杂交118

二、Northern杂交119

三、Western杂交119

四、其他分子杂交119

五、DNA微阵列分析120

六、探针的标记121

第四节 重组DNA分子导入大肠杆菌124

一、CaCl2转化法124

二、电转化法125

思考题126

主要参考文献126

第七章 基因操作中的核酸分析技术127

第一节 DNA和蛋白质相互作用分析127

一、凝胶阻滞实验127

二、DNase Ⅰ足迹实验128

三、体内足迹实验129

四、酵母单杂交技术130

五、染色质免疫沉淀法131

六、DNA-蛋白质相互作用研究技术的新进展132

第二节 RNA作图和端点分析133

一、RNA的S1核酸酶作图134

二、S1核酸酶作图分析mRNA的端点135

三、引物延伸法分析mRNA的端点135

第三节 RNA干扰技术136

一、RNAi现象的发现136

二、RNAi的作用机制137

三、RNAi技术中的关键问题137

四、RNAi技术的应用139

思考题139

主要参考文献140

第八章 PCR技术及其应用141

第一节 PCR技术原理和工作方式141

一、PCR的基本原理141

二、PCR反应体系142

三、PCR反应程序145

第二节 PCR产物的克隆146

一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点147

二、A/T克隆法147

三、平末端DNA片段的克隆148

四、长片段DNA的PCR扩增149

第三节 PCR扩增未知DNA片段151

一、反向PCR151

二、利用接头的PCR151

三、热不对称交错PCR153

第四节 与反转录相关的PCR154

一、cDNA末端的快速扩增154

二、差异显示PCR155

第五节 PCR产生DNA指纹157

一、多重PCR158

二、随机扩增多态性DNA158

三、扩增片段长度多态性158

第六节 实时定量PCR159

一、实时荧光定量PCR的定量方式159

二、荧光标记方式160

思考题162

主要参考文献162

第九章 DNA序列分析164

第一节 第一代DNA测序技术164

一、Maxam-Gilbert化学降解法测序技术164

二、Sanger双脱氧链终止法166

第二节 第二代测序技术171

一、454测序技术171

二、Solexa测序技术172

三、SOLiD测序技术174

四、离子肼测序技术177

第三节 单分子测序技术177

一、Heliscope单分子测序技术178

二、SMRT单分子测序技术178

三、纳米孔单分子测序技术178

四、现代测序技术的发展趋势和展望179

第四节 DNA片段序列测定的策略180

一、通用引物指导未知序列的测定180

二、引物步移180

三、随机克隆测序180

四、缺失克隆测序181

第五节 转录组测序182

一、RNA-seq技术简介182

二、mRNA-Seq技术流程182

三、mRNA的富集182

四、mRNA的测序184

第六节 核苷酸序列的生物信息分析184

一、序列分析和生物信息学的应用185

二、基因数据库和分析工具185

思考题186

主要参考文献186

第十章 DNA诱变188

第一节 随机诱变188

一、错误掺入诱变189

二、盒式诱变190

三、增变菌株的诱变作用191

四、化学诱变191

第二节 DNA体外重组192

一、DNA洗牌法193

二、交错延伸重组193

三、随机引发重组194

第三节 寡核苷酸介导的定点诱变195

一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程196

二、诱变寡核苷酸的设计196

三、不依赖于PCR的DNA定点诱变196

四、PCR介导的定点诱变199

第四节 嵌套缺失204

一、嵌套缺失的制备205

二、嵌套缺失的应用206

思考题207

主要参考文献207

第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选209

第一节 基因组DNA文库的构建210

一、基因组DNA文库的类型和发展210

二、文库的代表性和随机性211

三、基因组DNA文库的构建流程212

第二节 cDNA文库的构建212

一、cDNA文库的特征和发展212

二、cDNA文库的构建213

三、cDNA文库均一化处理218

四、扣除杂交cDNA文库218

五、全长cDNA文库221

六、其他cDNA文库222

第三节 基因克隆的筛选策略224

一、表型筛选法225

二、杂交筛选和PCR筛选225

三、免疫筛选225

四、酵母双杂交系统226

五、克隆基因的验证和分析226

第四节 DNA文库的保存227

思考题227

主要参考文献228

第十二章 基因组研究技术229

第一节 传统基因组研究技术229

一、基因组遗传图谱的构建230

二、基因组物理图谱的构建231

三、基因组测序234

第二节 现代基因组研究技术241

一、基因组序列的解读242

二、基因功能的预测和验证244

三、功能基因组学研究技术245

第三节 基因组工程250

一、基因工程与基因组工程250

二、基因组工程研究中的遗传同源重组系统251

思考题256

主要参考文献257

第二篇 基因工程应用261

第十三章 植物基因工程261

第一节 植物基因工程的发展现状261

第二节 植物基因工程方法263

一、原生质体介导法263

二、基因枪法265

三、根癌农杆菌介导法267

四、基因枪法与根癌农杆菌介导法的比较272

五、植物基因工程新技术272

第三节 转化子细胞的筛选272

一、植物基因工程中的选择基因273

二、报告基因273

第四节 转化体的鉴定与证实274

一、PCR检测外源基因的整合275

二、Southern杂交检测外源基因的整合275

三、RT-PCR检测外源基因的表达275

四、Northern杂交检测外源基因的表达275

五、Real-time PCR实时荧光定量PCR检测外源基因的表达276

六、Western杂交检测外源基因表达的产物276

第五节 植物基因工程研究的应用和展望276

一、抗性基因工程276

二、植物品质改良基因工程279

三、植物杂种优势的利用280

四、植物代谢工程280

五、生物反应器280

六、复合性状281

七、筛选标记基因的去除281

思考题282

主要参考文献282

第十四章 动物基因工程283

第一节 动物基因工程的发展现状与趋势283

一、精细与安全的动物遗传修饰新技术284

二、转基因动物将成为有限自然资源高效利用的主力军285

第二节 动物转基因技术285

一、动物基因工程载体285

二、载体相关调控元件293

三、基因转移技术294

第三节 转基因动物制备297

一、转基因动物的制备方法297

第四节 转基因动物鉴定与安全评价300

一、外源基因的基因组水平鉴定300

二、转基因动物中外源基因表达水平检测301

三、转基因动物中目标基因的蛋白水平测定301

四、转基因动物传代与检测302

五、转基因动物及其产品的安全性评价302

第五节 转基因动物的应用与展望303

一、转基因动物的应用303

二、转基因动物的展望305

思考题305

主要参考文献305

第十五章 酵母基因工程307

第一节 酵母基因工程的发展现状和发展趋势307

一、酵母基因工程的优点307

二、酵母基因工程的发展现状308

三、酵母基因工程的发展趋势309

第二节 酵母表达系统311

一、酵母表达系统概述311

二、常用酵母表达系统313

第三节 酵母基因工程的应用319

一、酵母基因工程的应用情况319

二、酵母基因工程的应用举例321

思考题323

主要参考文献323

第十六章 细菌基因工程325

第一节 细菌基因工程的发展现状和发展趋势325

一、细菌基因工程的发展简史325

二、细菌基因工程的发展现状325

三、细菌基因工程的发展趋势及前景展望327

第二节 细菌基因工程的表达系统327

一、细菌基因工程的表达系统327

二、表达载体构建原则328

三、外源基因表达的方式328

四、常见细菌表达系统329

第三节 细菌基因工程的应用332

一、农业领域的基因工程细菌332

二、食品和工业基因工程菌336

三、重组DNA技术生产医用抗生素339

四、环境微生物基因工程菌的应用342

思考题346

主要参考文献346

第十七章 病毒基因工程348

第一节 病毒载体349

一、动物病毒载体349

二、植物病毒载体358

三、噬菌体载体358

第二节 病毒与基因工程359

一、基因工程病毒疫苗359

二、病毒与基因治疗362

三、溶瘤病毒与癌症治疗363

四、病毒与生物防治364

思考题368

主要参考文献369

第十八章 医药基因工程370

第一节 基因工程药物的开发现状与发展趋势371

一、基因工程药物的种类371

二、基因工程药物的产业化状况372

三、基因工程药物的发展趋势372

第二节 基因工程蛋白和多肽药物374

一、基因工程胰岛素375

二、基因工程人红细胞生成素376

三、基因工程干扰素377

四、基因工程疫苗378

五、基因工程抗体380

第三节 基因工程抗体380

一、抗体的结构380

二、天然抗体的局限性381

三、基因工程抗体的种类382

第四节 基因工程核酸类药物385

一、反义核酸药物386

二、核酸疫苗388

三、RNA干扰389

四、基因治疗390

思考题392

主要参考文献392

第十九章 基因工程产品的安全评价及其管理393

第一节 基因工程产品的安全评价393

一、DNA重组生物安全准则393

二、转基因生物产品的安全评价原则393

第二节 基因工程产品的安全性管理类型394

第三节 基因工程技术安全性探讨及其产品的发展前景396

附录 转基因农作物产品的安全性争论事件398

一、食用安全争议事件398

二、生态安全事例399

思考题400

主要参考文献400

索引401