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第一篇 生物化学与分子生物学实验技术的基本原理2

第1章 分光光度技术2

第一节 基本原理2

一、光的基本知识2

二、朗伯一比尔定律3

第二节 分光光度技术的应用4

一、定量分析4

二、定性分析5

三、纯度检测6

四、分光光度法的误差6

第三节 分光光度计的基本结构及使用6

一、分光光度计的基本构造6

二、常见分光光度计的使用7

三、分光光度计使用的注意事项9

第2章 电泳技术10

第一节 基本原理10

一、电泳的原理10

二、影响电泳速度的外界因素11

第二节 电泳分类11

一、按工作原理分类11

二、按分离目的分类12

三、按用法分类12

第三节 常用电泳技术12

一、纸电泳12

二、醋酸纤维素薄膜电泳13

三、琼脂糖凝胶电泳14

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳14

五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳16

六、等电聚焦电泳16

七、双向凝胶电泳17

八、免疫电泳19

九、毛细管电泳20

第四节 电泳装置的结构及使用21

一、电泳装置21

二、使用方法24

第3章 层析技术26

第一节 基本原理26

一、层析的基本概念26

二、层析的基本原理27

三、层析技术的分类28

第二节 吸附层析29

一、吸附层析的原理29

二、吸附层析的分类30

三、吸附剂和洗脱剂的选择31

第三节 分配层析31

一、分配层析的原理31

二、纸层析32

第四节 离子交换层析33

一、离子交换层析的原理33

二、离子交换剂的类型34

三、离子交换层析的应用34

四、离子交换树脂的处理34

第五节 凝胶层析35

一、凝胶层析的原理35

二、凝胶层析的实验技术36

三、凝胶层析的应用38

第六节 亲和层析38

一、亲和层析的原理39

二、亲和层析的基本过程39

三、亲和层析载体、配体的选择与偶联39

第4章 离心技术41

第一节 离心技术的基本原理41

一、离心力41

二、相对离心力42

三、沉降系数42

第二节 离心分离的常用方法42

一、沉淀离心法42

二、差速离心法43

三、密度梯度离心法44

第三节 离心机的分类及使用45

一、制备型离心机46

二、分析型离心机47

三、离心操作注意事项及其维护保养47

第5章 核酸分子杂交技术49

第一节 基本原理49

一、DNA的变性49

二、DNA的复性50

三、核酸分子杂交50

第二节 核酸探针及其标记50

一、核酸探针51

二、探针的标记52

第三节 常用核酸分子杂交技术55

一、固相杂交技术55

二、液相杂交技术57

三、核酸分子杂交实验条件的优化58

第二篇 生物化学与分子生物学实验概论64

第6章 生物化学与分子生物学实验的基本要求64

第一节 实验室的基本要求64

一、实验室规则64

二、实验室安全64

第二节 实验记录与实验报告的基本要求66

一、实验记录66

二、实验数据的处理70

三、实验误差分析与处理71

四、实验报告的要求76

第7章 生物化学与分子生物学实验基本技能训练78

第一节 基本操作技能78

一、玻璃仪器的洗涤与干燥78

二、溶液的混匀79

三、过滤、加热与冷却80

第二节 基本器材与仪器的使用82

一、刻度吸管的使用82

二、可调微量移液器的使用83

三、容量瓶的使用83

四、电子天平的使用84

五、pH计的使用85

第8章 生物化学与分子生物学实验样品的制备88

第一节 样品制备的基本原则与策略88

一、生物样品制备的基本原则88

二、生物样品制备的基本策略89

第二节 常用实验样品的制备89

一、血液样品89

二、尿液样品90

三、组织样品90

四、微生物样品91

五、植物样品92

第三节 生物大分子的制备92

一、核酸的分离纯化92

二、蛋白质的分离纯化93

第三篇 基本型实验98

第9章 蛋白质、氨基酸实验98

第一节 蛋白质的定量测定98

实验1蛋白质的定量测定（微量凯氏定氮法）98

实验2蛋白质的定量测定（双缩脲法）103

实验3蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）105

实验4蛋白质的定量测定（BCA法）107

实验5蛋白质的定量测定（考马斯亮蓝染色法）109

实验6蛋白质的定量测定（紫外吸收法）111

第二节 蛋白质相对分子量测定（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）113

第三节 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量120

第四节 氨基酸的薄层层析124

第五节 氨基酸的纸层析128

第10章 酶学实验132

第一节 过氧化氢酶米式常数的测定132

第二节 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定135

第三节 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制138

第四节 乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖电泳法测定140

第11章 糖类、脂类实验143

第一节 血糖的定量测定143

实验1血糖的定量测定（Folin-吴宪法）143

实验2血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法）147

实验3血糖的定量测定（己糖激酶法）149

第二节 乳酸的定性分析与定量测定151

实验1尿中乳酸含量的定性分析152

实验2血液中乳酸含量的定量测定153

第三节 血清甘油三酯的测定（乙酰丙酮显色法）155

第四节 血清总胆固醇的测定（胆固醇氧化酶法）158

第12章 核酸实验161

第一节 核酸的定量测定161

实验1核酸的定量测定（定磷法）161

实验2核酸的定量测定（紫外吸收法）164

实验3DNA的定量测定（二苯胺法）165

实验4RNA的定量测定（地衣酚法）167

第二节 核酸的琼脂糖凝胶电泳169

实验1 DNA的琼脂糖凝胶电泳169

实验2 RNA的甲醛变性凝胶电泳172

第三节 核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳174

第四节DNA的聚合酶链式反应177

第四篇 综合设计型实验186

第13章 综合性实验186

第一节 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与定量186

第二节 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析196

实验1碱性磷酸酶的分离纯化和比活性测定196

实验2底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响199

实验3 pH对碱性磷酸酶活性的影响203

实验4温度对碱性磷酸酶活性的影响205

第三节 肝糖原的提取、鉴定与定量207

实验1肝糖原的提取与鉴定207

实验2肝糖原定量测定209

第四节 血清脂蛋白的电泳分离与定量测定211

实验1血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳213

实验2血清高密度脂蛋白-胆固醇的分离与定量测定（磷钨酸-镁沉淀法）216

第五节 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定218

实验1质粒DNA的小量提取（碱裂解法）219

实验2高纯质粒小量制备（试剂盒法，离心柱型）224

实验3质粒DNA的定量（紫外分光光度法）226

实验4质粒DNA的酶切鉴定228

第六节 基因组DNA的提取、定量与鉴定232

实验1细菌基因组DNA的提取、定量与鉴定232

实验2动物组织基因组DNA的提取、定量与鉴定235

第七节总RNA的提取、定量与逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）239

实验1总RNA的提取与定量239

实验2逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）243

第八节Southern杂交248

实验1基因组DNA样品的限制性酶切248

实验2酶切样品的琼脂糖凝胶电泳250

实验3DNA的变性、转膜与固定252

实验4杂交与杂交后清洗255

实验5杂交结果的检测257

第九节 斑点或狭缝杂交258

第14章 设计性实验265

第一节 设计性实验的基本程序265

一、选题定题265

二、实验设计266

三、实验实施269

四、实验总结269

第二节 生物化学与分子生物学实验设计的基本思路270

一、蛋白质研究的实验设计270

二、酶学研究的实验设计275

三、核酸研究的实验设计277

四、糖类化合物的实验设计280

五、脂类及维生素的实验设计282

附：实验设计书范例284

第五篇 研究创新型实验294

第15章 分子克隆实验294

第一节 目的基因的分离与载体的选择294

实验1目的基因的分离294

实验2载体的选择297

第二节 目的基因与载体的限制性酶切及酶切产物的回收301

实验1目的基因与载体的限制性酶切301

实验2酶切产物的回收304

第三节 目的基因与载体的连接307

实验1酶切产物的克隆（T4 DNA连接酶法）308

实验2 PCR产物的TA克隆311

第四节 重组DNA的导入314

第五节 阳性重组体的筛选与鉴定317

实验1阳性重组体的筛选（a-互补法）317

实验2阳性重组体的鉴定（菌落PCR法）320

第六节 目的基因的表达及鉴定321

第16章 基因芯片实验325

第一节 限制性基因芯片探针的制备325

第二节 基因芯片实验样品的限制性荧光标记330

第三节 基因芯片的表面处理与质控335

第六篇 生物化学与分子生物学实验常用数据340

第17章 试剂的配制与保存340

第一节 化学试剂分级及注意事项340

一、化学试剂纯度分级表340

二、试剂配制的一般注意事项340

三、易变质及需要特殊方法保存的试剂341

第二节 常用试剂及溶液的配制341

一、常用清洗液的配制341

二、常用试剂的配制342

三、常用缓冲液的配制344

四、电泳常用缓冲液的配制349

五、常用储存液的配制350

第三节 细菌实验试剂的配制与保存351

一、细菌培养基的配制351

二、抗生素的配制353

三、细菌的保存354

第18章 常用数据表355

一、常用蛋白质相对分子质量标准数据355

二、氨基酸的主要参数355

三、核酸、蛋白质换算数据356

四、常用核酸相对分子质量标准数据356

五、琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围357

六、PAGE凝胶配表（核酸电泳用）357

七、SDS-PAGE的浓缩胶（5％Acrylamide）配方表358

八、SDS-PAGE分离胶配方表358

九、SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围359

附录A英文版实验指导360

Introduction to Biochemistry Experiments360

Experiment 1 Determination of protein content by Lowry's method363

Experiment 2 Protein identification by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis365

Experiment 3 Electrophoresis on cellulose acetate membrane of serum proteins371

Experiment 4 Amino Acid Identification by Thin Layer Chromatography374

Experiment 5 Extraction, Identification and Quantification of liver glycogen377

Experiment 6 Plasmid DNA Miniprep,Quantification and Restriction Digestion Analysis381

Experiment 7 Total RNA isolation and Reverse Transcription-Polyrnerase Chain Reaction（RT-PCR）389