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第一章 媒介与宿主系统1

（壹）质体2

一　选殖DNA至质体中的方法10

（贰）λ噬菌体15

一 溶裂循环18

二 潜溶作用21

三 制造λ噬菌体媒介22

四 选择适当的媒介23

五 λ媒介的遗传图24

（叁）凝聚质体44

（肆）拥有单股核酸的噬菌体50

（伍）结论51

第二章　菌株及噬菌体的繁殖与保存55

壹 菌落的纯化程序57

贰 菌株的生长，维持与保存59

叁 λ噬菌体溶菌斑的纯化程序61

肆 培养基与抗生素65

第三章 λ噬菌体及质体DNA的分离71

壹 大量λ噬菌体的制备72

（壹）噬菌体的感染72

（贰）噬菌体的诱发73

（叁）λ噬菌体的纯化75

（肆）λ噬菌体DNA的抽取79

贰 质体DNA大量分离法80

（壹）菌体的生长以及质体的繁殖81

（贰）菌体的收集与溶裂82

（叁）利用Cesium Chloride-Ethidium Bromide密度梯度衡定离心的技术纯化环状DNA85

（肆）质体DNA样品中RNA的去除86

第四章　分子选殖必需的酶类89

壹 限制酶90

（壹）同座限制酶91

（贰）甲基化作用94

（叁）利用限制酶分解DNA96

贰 适用于分子选殖技术的他种酶类98

（壹）大肠菌DNA聚合酶Ⅰ98

（贰）大肠菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段103

（叁）T4 DNA聚合酶107

（肆）利用T4聚核苷酸激酶标志DNA的5′末端112

（伍）转录RNA的DNA聚合酶117

（陆）DNA脱磷酸作用122

（柒）Bal 31核酸酶124

核酸酶S1128

绿豆核酸酶129

核糖核酸酶129

脱氧核糖核酸酶Ⅰ130

外核酸酶Ⅶ130

外核酸酶Ⅲ131

λ外核酸酶132

聚（A）聚合酶133

T4 DNA接合酶134

T4 RNA接合酶135

Eco RI修饰酶135

末端脱氧核糖核苷酸转移酶136

第五章　胶体电泳137

壹 琼脂糖胶体电泳138

（壹）胶体电泳器140

（贰）缓冲液140

（叁）琼脂糖胶体的配制143

（肆）琼脂糖胶体中DNA的染色146

（伍）胶体的照像147

（陆）迷你胶体147

（柒）琼脂糖胶体上DNA的回收149

（捌）碱性琼脂糖胶体154

贰 聚丙烯醯胺胶体电泳155

（壹）聚丙烯醯胺胶体的装备方法156

（贰）DNA自聚丙烯醯胺胶体上的回收160

叁　DNA分股用的胶体160

（壹）利用聚丙烯醯胺胶体分离DNA的两股161

（贰）利用琼脂糖胶体分离DNA的两股162

（叁）利用变性溶液与聚丙烯醯胺胶体电泳分离短小DNA的两股164

第六章　真核细胞m-RNA的抽取，纯化与分析167

（壹）分离哺乳动物细胞中的mRNA170

（贰）细胞中全部RNA的分离法172

（叁）聚腺苷酸RNA的筛选174

（肆）RNA的胶体电泳176

（伍）利用核酸酶S1图谱RNA182

第七章　反讯息DNA的合成及选殖185

壹 反讯息DNA的合成186

（壹）反讯息DNA第一股的制造186

（贰）反讯息DNA第二股的制造188

（叁）利用核酸酶S1切除反讯息DNA上的发夹状圆弧189

贰 双股反讯息DNA的分子选殖190

（壹）含同种聚合物的尾端190

（贰）人工制造的DNA接头192

（叁）选殖反讯息DNA的其他方法194

叁 反讯息DNA选殖的策略197

（壹）量多mRNA转录为反讯息DNA197

（贰）量少mRNA转录为反讯息DNA198

肆 选殖反讯息DNA的程序203

（壹）双股反讯息DNA的合成方法203

（贰）利用核酸酶S1分解反讯息双股DNA209

（叁）反讯息双股DNA的选殖212

（肆）媒介DNA与反讯息双股DNA的氮基冷却配对215

（伍）利用先后添加接头的方式选殖反讯息双股DNA215

第八章　转移质体及λ噬菌体DNA于大肠菌体内的技术219

壹 转化质体DNA于大肠菌体内的程序220

（壹）使用氯化钙的转化程序221

（贰）使用氯化钙与氯化铷的转化程序222

（叁）使用大肠菌x1776菌株的转化程序223

贰 在活体外装填λ噬菌体DNA的方法225

（壹）潜溶性λ噬菌体的保存与测定227

（贰）制造装填用噬菌体——程序Ⅰ229

（叁）活体外装填DNA——序Ⅰ230

（肆）制造装填用噬菌体——程序Ⅱ232

（伍）活体外装填DNA——程序Ⅱ234

第九章　建立基因组集合库237

壹 利用λ噬菌体媒介建立基因组的集合库238

（壹）制造媒介DNA242

（贰）利用组织培养皿上的真核细胞分离高分子量的DNA246

（叁）制备长度为20kb的真核细胞DNA248

（肆）DNA的接合与装填252

（伍）集合库中噬菌体的增数257

贰 利用凝聚质体建立基因组集合库258

（壹）利用磷酸盐酶处理的凝聚质体作为携带选殖DNA的媒介259

（贰）利用两种限制酶及磷酸盐酶处理的凝聚质体作为携带选殖DNA的媒介263

（叁）含有选殖DNA的集合库的增数，贮存，以及筛选267

第十章　含有重组DNA的纯系的鉴定271

壹 菌落或溶菌斑的原位杂合273

（壹）少量菌落的杂合273

（贰）复印菌落于硝化纤维滤纸上的程序276

（叁）利用杂合作用鉴定λ噬菌体的溶菌斑278

（肆）λ噬菌体溶菌斑在原位增数后再以杂合法鉴定的程序280

（伍）固定于滤片上的DNA或RNA与辐射性探测核酸杂合的程序281

（陆）复印有噬菌体溶菌斑或者细菌菌落的滤片与探测核酸杂合的程序283

贰 利用杂合筛选法鉴定含有反讯息DNA的菌落或噬菌体286

（壹）利用固定于硝化纤维滤片上的DNA从事杂合筛选286

（贰）利用杂合作用筛选的RNA在网织红血球溶裂液中转译产生蛋白质295

（叁）注射mRNA于蛙卵细胞中以转译的方式产生蛋白质299

叁 利用探测DNA与特定序列的DNA在大肠菌体内重组的现象筛选集合库中携带特殊外来DNA段落的λ噬菌体302

（壹）重组筛选法的原理302

（贰）筛选πVX质体用的菌株306

（叁）πVX质体的制备306

（肆）质体进入W3110r-m+（P3）菌株的转化作用306

（伍）利用λ噬菌体集合库感染W3110r-m+（P3）（πVX）菌株307

（陆）鉴定噬菌体的阻遏基因307

（柒）测试πVX质体系统307

（捌）πVX系统的应用310

第十一章　含重组DNA纯系的分析313

壹 λ噬菌体DNA或者质体DNA的快速分离314

（壹）质体DNA小规模快速的分离314

（贰）λ噬菌体DNA小规模快速的分离317

贰 建立DNA上限制座分布的图形319

（壹）单一或共同分解320

（贰）依次分解321

（叁）局部分解323

叁 Southern转移法326

（壹）转移琼脂糖胶体中的DNA至硝化纤维滤纸上的程序327

（贰）DNA转移至滤片上以后的杂合程序329

肆 分殖小假DNA于质体媒介中的程序331

（壹）具有凝聚末端的DNA的分殖法332

（贰）利用人造接头协助DNA的分殖工作333

（叁）接合二齐尾DNA作为产生限制座的方法337

（肆）选殖步骤快速依次进行的方法339

第十二章　能够在大肠菌体内表现其所携带之选殖DNA的媒介质体341

壹 促进因子342

（壹）利用λ噬菌体的PL促进因子的媒介质体343

（贰）其他的促进因子347

贰 核糖体结合座347

叁 真核细胞基因的表现348

（壹）使选殖DNA产生非融合性真核细胞蛋白质的媒介348

（贰）使选殖DNA产生融合性真核细胞蛋白质的媒介355

肆 选殖基因的高度表现366

伍 增加基因的数量369

陆 摘要370

附录373

壹 附录A：生化技术374

（壹）玻璃及塑胶器皿374

（贰）配制有机溶剂375

（叁）液体培养基376

（肆）含洋菜或者琼脂糖的固体培养基378

（伍）浓缩培养基378

（陆）用于λ噬菌体实验的溶液378

（柒）抗生素379

（捌）缓冲液与其他溶液的配制380

（玖）酶类385

（拾）限制酶分解程序必需的缓冲液387

（拾壹）常用的电泳缓冲液388

（拾贰）常用的装填染料389

（拾叁）透析膜袋的清洗390

（拾肆）乙醇与水混合溶液中32P-核苷酸的干燥方法390

（拾伍）核酸的纯化391

（拾陆）核酸的浓缩393

（拾柒）Sephadex G-50层析程序395

（拾捌）DNA及RNA的定量398

（拾玖）自动辐射照像术400

（贰拾）测量核酸的辐射活性402

（贰拾壹）剪接质体成长短不一的段落作为分子量比较的标志403

（贰拾贰）Maxam-Gilbert的DNA序列分析技术404

贰 附录B：pBR322408

（壹）pBR322的核苷酸序列408

（贰）pBR322上的限制座417

（叁）pBR322 DNA上含有限制座的段落422

叁 附录C：常用的细菌菌株433

参考文献437

索引451