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目录3

第一部分　基因分析技术3

第一章 cDNA文库的构建3

第一节　cDNA文库构建的基本原理3

一、cDNA的合成4

二、ZAP表达载体的结构4

第二节　cDNA文库构建的具体操作步骤6

一、cDNA第一链的合成7

二、cDNA第二链的合成7

三、补平cDNA链末端8

四、EcoRⅠ接头的连接9

五、EcoRⅠ末端的磷酸化9

六、XhoⅠ酶切9

七、过柱分离cDNA9

八、cDNA与ZAP表达载体的连接12

九、准备宿主菌13

十、应用Gigapack Ⅲ Gold包装蛋白包装含有cDNA的ZAP重组载体13

十一、铺盘和库容量鉴定13

十二、原始库的扩增13

第一节　基因组差减杂交法15

第二章　差减杂交法和差减文件的构建15

第二节　mRNA或cDNA差减杂交法16

一、羟基磷灰石（HAP）柱层析法17

二、生物素-链亲和素的亲和分离17

三、基于PCR反应的差减杂交法或抑制性差减杂交（SSH）22

四、基因或表达序列文库（cDNA or EST libraries）杂交26

第三章　mRNA差异显示技术28

第一节　mRNA DD-PCR的基本原理28

一、组织样品总RNA的提取29

第二节 mRNA DD-PCR技术的具体操作步骤29

二、去除RNA样品中的微量DNA30

三、引物序列31

四、反转录归类反应体系的建立………………………………………………………（31 ）五、PCR选择性扩增32

六、mRNA DD-PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳33

七、差异表达条带的回收33

八、回收条带的再次扩增34

九、二次扩增产物的克隆、测序和GenBank查询36

十、Northern Blot和Dot Blot杂交36

一、FISH技术的原理和优点40

第四章　荧光原位杂交（FISH）技术40

第一节　FISH的原理和技术特点40

二、FISH技术的基本操作过程41

第二节　FISH技术的实验操作步骤43

一、染色体标本的制备43

二、染色体显带44

三、Alu-PCR法制备探针45

四、切口平移法标记探针45

五、FISH检测46

一、FISH技术的发展48

第三节　FISH技术的发展与应用48

二、FISH技术的主要应用49

第五章　辐射性杂交51

第一节　辐射性杂交的基本原理51

一、构建RH图谱的方法52

二、RH嵌板53

第二节　RH图谱的应用54

一、EST定位54

三、基因克隆55

二、寻找新基因55

四、测定距离56

五、RH相关网站及RH数据库56

六、RH的优缺点57

第六章　计算机克隆及染色体定位58

第一节　计算机克隆58

一、基本原理58

二、现状与发展58

四、一点经验59

三、操作步骤59

五、简单实例60

第二节　染色体定位61

第三节　掌握和熟悉NCBI数据库和分析64

第七章　核酸及蛋白序列的计算机初步分析66

第一节　概述66

第二节　核酸序列分析69

一、数据库同源性或相似性搜索69

二、读码框分析69

一、同源性或相似性分析70

第三节　蛋白序列分析70

三、寻找启动子区及其核酸序列中的功能位点70

四、基因的染色体定位70

二、氨基酸序列的一般特性分析71

三、蛋白基序和结构域分析71

四、特殊结构或结构特征分析71

五、直系同源物（Ortholog）和／或旁系同源物（Paralog）分析72

六、二级结构的预测72

一、多重序列排列73

二、分子进化分析73

第四节　多重序列排列和系统发育分析73

三、举例75

第五节　刊有生物信息学的期刊79

第八章　酵母双杂交技术80

第一节　酵母双杂交原理80

一、原理80

二、酵母双杂交的基本流程81

第二节　酵母双杂交系统中常用的菌株与表达载体82

一、酵母菌的一般特点82

二、常用的菌株82

三、表达载体的构建83

四、表达载体与菌株表型之间的关系85

五、对照载体的构建85

六、酵母培养基的制备86

七、菌株冻存与复苏88

八、酵母菌的培养89

第三节　诱饵质粒的鉴定89

一、制备感受态酵母菌89

二、诱饵质粒转化入感受态酵母细胞90

三、诱饵蛋白的毒性检测90

四、诱饵蛋白自激活检测91

五、交配效率的检测与计算92

第四节　正式筛选预转化cDNA文库93

一、筛选前的准备93

二、正式筛选预转化的cDNA文库94

三、文库滴定（Library Titering）96

四、计算酵母交配的效率和筛选的克隆数96

第五节　对初步获取的阳性克隆的分析与验证97

一、克隆表型验证——大规模筛选97

二、β-半乳糖苷酶活性分析97

三、酵母质粒DNA的提取99

四、酵母质粒转入大肠杆菌DH5α100

五、克隆归类101

六、在酵母体内再验证蛋白的相互作用102

七、在酵母体外分析和验证蛋白的相互作用103

八、测序103

第六节　酵母双杂交技术的应用103

一、酵母双杂交技术的应用103

二、酵母双杂交技术的缺陷104

三、使用酵母双杂交技术应注意的问题104

第一节　SELEX技术简介105

第九章　SELEX技术105

第二节　SELEX技术的基本原理106

一、SELEX技术的基本路线106

二、Aptamer的修饰与优化108

三、影响SELEX技术的因素111

第三节　核酸配基结合的特异性评价116

一、配基结合特异性116

二、配基序列及空间结构分析117

二、复合靶分子SELEX118

一、导向SELEX118

第四节　SELEX技术的改进与发展118

三、基因组SELEX119

第五节 适配分子的特性119

第六节　SELEX技术和适配分子在各方面的应用120

一、SELEX技术在各方面的应用120

二、Aptamer在各方面的应用122

第十章　基因打靶技术135

第一节　基因打靶技术的概念及发展历史135

一、基因打靶技术的概念135

二、胚胎干细胞技术的发展136

三、同源重组技术的发展137

第二节　基因打靶技术在生物医学研究中的应用前景138

一、基因打靶技术在基因功能研究中的应用138

二、应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型139

三、应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器139

第三节　研制基因打靶小鼠的实例—Smad5基因剔除小鼠的研制和鉴定140

一、靶基因cDNA探针的克隆140

二、靶基因基因组DNA片断的筛选和克隆140

三、基因剔除打靶载体的构建以及中靶ES细胞的筛选141

四、基因剔除小鼠的获得及鉴定142

五、基因剔除小鼠的表型分析143

第四节　常用实验操作方法144

一、小鼠基因组DNA的制备144

二、基因组DNA的PCR分析144

三、基因组DNA的Southern杂交分析144

四、用原代小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层145

五、小鼠胚胎干细胞的常规培养146

六、ES细胞的冻存和复苏147

一、转基因、转基因动物与转基因动物模型149

第十一章　转基因动物技术149

第一节　原理和方法149

二、目的基因的设计150

三、转基因的方法150

第二节　显微注射法的操作步骤153

一、实验条件的准备153

二、供体鼠和受体鼠的同步准备156

三、受精卵的采集157

四、受精卵的显微注射157

五、转基因后受精卵的再植158

一、基因组DNA的提取159

第三节　转基因整合与表达的检测159

二、外源基因的检测160

第十二章　RNA干扰164

第一节　RNA干扰的原理164

第二节　RNA干扰的生物功能165

第三节　哺乳类中的RNA干扰165

一、RNAi在哺乳动物中存在的证据165

二、哺乳动物中的RNAi165

第四节　RNA干扰的实验过程166

一、RNAi的产生166

三、长dsRNA引发的RNAi166

四、哺乳类稳定RNAi166

二、给予途径169

三、沉寂效应鉴定169

四、存在问题169

第五节　RNA干扰在生物医学和功能基因组中的应用169

第十三章　常用数据库及分子生物学软件171

第一节　常用数据库173

第二节　分子生物学常用软件175

第二部分　生物芯片技术179

第十四章　生物芯片概介179

第一节　生物芯片产生的科技背景及在医学中应用的优势179

一、生物芯片的定义和特点179

二、生物芯片产生的科技背景180

三、生物芯片在医学中的应用概况与前景181

第二节　生物芯片相关分子生物学概念185

一、基因185

二、基因组和基因组的信息含量185

三、真核基因组和原核基因组186

四、基因表达187

五、基因突变187

六、基因多态性187

七、DNA的变性与复性188

八、探针188

九、杂交189

十、PCR190

第三节　生物芯片的分类简介191

一、芯片载体和载体材料193

第一节　载体的表面修饰193

第十五　章生物芯片的制备和检测193

二、载体化学修饰195

三、载体修饰后的固定及选择原理199

第二节　生物芯片制作方式199

一、微阵列芯片及其制备技术199

二、微流控芯片及其制备技术203

三、其他类型芯片制作方式204

四、基因芯片和寡核苷酸芯片制备原理205

第三节　生物芯片检测的实验流程207

一、芯片样品的制备208

二、杂交探针的种类和标记214

三、核酸分子杂交和杂交微环境217

四、DNA微阵列操作应用实例219

第四节　芯片杂交信号的收集及生物信息的分析232

一、芯片杂交信号的收集及处理232

二、生物信息的分析和提取234

第十六章　微阵列探测中的共聚焦扫描技术243

第一节　微阵列技术、荧光及荧光探测245

一、微阵列探测特征245

二、荧光基础理论246

三、荧光探针的选择247

四、探测设备的光学设计要求248

第二节　样品处理253

一、标准显微载玻片254

二、其他规格载玻片254

三、样品环境254

第三节　共聚焦扫描原理254

一、共聚焦原理254

二、共焦微阵列扫描仪255

三、共聚焦系统优点与缺点257

四、共聚焦扫描实现与折衷考虑257

第四节　共聚焦扫描仪光学设计及关键特征258

一、波长鉴别258

二、探测器260

三、信号处理及仪器控制260

四、扫描仪功能参数262

第五节　ScanArray？型共聚焦微阵列扫描仪264

一、扫描仪的集成化264

二、ScanArray？扫描仪结构组成265

三、ScanArray？扫描器优点266

第十七章　生物芯片在医学中的应用268

第一节　生物芯片技术在基因组功能研究中的应用268

一、寻找和发现新基因268

二、基因表达分析269

三、DNA序列测定与序列间比较271

四、突变体和多态性的检测271

第二节　生物芯片技术用于单核苷酸多态性的检测273

一、SNPs的检测技术273

二、SNPs技术的应用283

第三节　生物芯片技术在遗传性疾病诊断中的应用290

一、遗传性疾病的分类290

二、遗传性疾病与基因突变291

三、基因突变检测技术293

四、遗传性疾病基因芯片295

五、遗传性疾病的基因芯片的应用301

第四节　生物芯片技术在肿瘤研究中的应用303

一、肿瘤基因表达谱的研究303

二、寻找肿瘤相关基因305

三、肿瘤分型的研究309

四、肿瘤相关基因功能的研究312

五、肿瘤诊断的研究314

六、筛选抗癌药物和监测肿瘤治疗效果317

第五节　生物芯片在肝癌及病毒性肝炎诊断中的应用319

一、基因芯片技术在肝癌研究中的应用319

二、基因芯片技术在病毒性肝炎及其他肝病诊断中的应用323

第六节　生物芯片技术在微生物变异及疾病耐药性检测中的应用327

一、生物芯片在微生物基因变异检测中的应用327

二、生物芯片在疾病耐药性检测中的应用336

三、前景与展望342

第七节　生物芯片技术在药学方面的应用343

一、生物芯片在药物靶点发现与药物作用机制研究中的应用343

二、生物芯片在毒理学研究中的应用347

三、生物芯片作为超高通量药物筛选平台的应用348

四、生物芯片在药物基因组学中的应用350

五、基因芯片技术在疾病耐药性检测中的应用351

六、生物芯片对中药物种的鉴定351

第八节　生物芯片技术在法医学中的应用351

一、生物芯片在法医物证学中的应用351

二、生物芯片在法医病理学中的应用360

三、生物芯片在痕量物证及毒品和毒物分析中的应用366

四、前景与展望367

第十八章　蛋白质芯片368

第一节　蛋白质芯片产生的背景368

一、后基因组时代368

二、蛋白质组学的兴起与发展369

三、传统技术的改造和新技术的产生369

第二节　蛋白质芯片的基本原理371

二、蛋白质芯片的分类372

一、蛋白质芯片的特点372

三、蛋白质芯片制作和检测的基本流程374

四、蛋白质芯片的功能作用377

五、蛋白质芯片的相关技术380

第三节　蛋白质芯片在医药学上的应用进展382

一、发现新的疾病标志物作为临床诊断的指标383

二、对疾病病理分子机制的研究385

三、筛选药物靶，发现新药物，研究药理机制385

第四节　蛋白质芯片的发展展望386

参考文献389