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制备方法3

手摇法制备多层脂质体5

超声法制备脂质体6

冻干再水化脂质体（FRV）制备过程中包封标记转铁蛋白8

逆相蒸发法制备脂质体9

以交叉过滤法去除表面活性剂制备脂质体12

挤出法制备脂质体94

脂质体的纯化19

凝胶过滤法分离蛋白脂质体20

分离REV蛋白脂质体中未结合的蛋白质21

微柱离心法分离脂质体与低分子质量物质21

脂质体组分的化学分析25

Bartlett法测定无机磷酸盐26

Stewart法测定磷脂27

脂质的TLC28

（磷）脂的HPLC分析31

胆固醇和α-生育酚的HPLC分析33

脂肪酸的GC分析35

UV吸收法测定共轭二烯和三烯36

TBA法测定内过氧化物37

碘量法测定氢过氧化物38

脂质体的物理表征40

微柱离心法41

鱼精蛋白聚集法42

偶氮砷Ⅲ法测定释放率45

羧基荧光素脂质体的制备和应用48

含葡萄糖脂质体的制备和应用49

其他方法57

Bligh和Dyer萃取法57

Sep-Pak微柱萃取58

羧基荧光素溶液的配制59

钙黄绿素溶液的配制60

DSC测量的实际问题66

脂质体的DSC研究68

脂质体的HSDSC研究69

冻干脂质体的MTDSC研究71

荧光分析法研究脂质体融合81

测定脂质体水性内容物混合的铽／二吡啶羧酸分析法82

逆相蒸发法制备大单层脂质体84

小单层脂质体的制备85

磷酸盐分析法测定融合分析用脂质体的磷脂浓度86

ANTS/DPX融合分析87

N-NBD-PE/N-Rh-PE RET分析法测定膜融合过程的脂质混合89

荧光分析测定内侧单分子层的混合91

荧光法检测蛋白质与磷脂膜的结合93

蛋白质结合引起的芘单体荧光强度变化的测定94

挤出法制备脂质体94

色氨酸淬灭实验96

脂质体作为pH传感器研究细胞相互作用97

将Pyranine包封于脂质体中用作细胞摄取的探针98

荧光分光光度法研究脂质体的细胞摄取99

荧光显微法研究脂质体的细胞摄取101

用脂质体双荧光团法测定细胞内pH103

双光子激发荧光显微法检测巨大型脂质体中的脂质相104

巨大型单层脂质体（GUV）的制备106

脂质体的冻干120

脂质体的冻干126

磷脂浓度的测定130

磷酸盐分析法测定磷脂浓度131

用确定孔径的聚碳酸酯膜挤出制备大单室脂质体132

挤出法制备LUV［DSPC/Chol,（55∶45）］132

弱碱性药物基于跨膜pH梯度在LUV中积聚133

弱碱性药物（如阿霉素）主动载入具跨膜pH梯度的LUV135

弱碱性药物（如环丙沙星）主动载入具跨膜铵梯度的LUV137

弱碱性药物（如长春新碱）经离子载体-介导而载入具跨膜离子梯度的LUV139

包封基因药物的脂质体系统：用于体内递送基因和反义寡核苷酸的长循环载体140

通过表面活性剂透析法将质粒DNA包封入稳定的质粒-脂质粒子（SPLP）141

通过聚核苷酸“乙醇-依赖”摄入预制囊泡工艺将反义寡核苷酸包封入稳定的反义-脂质粒子（SALP）144

蛋白质和多肽连接到脂质体表面149

用酸酐对PE进行衍生化151

心肌磷脂的衍生化152

有表面活性剂存在下，用NGPE对抗体进行疏水化，再通过透析法将其插入脂质体153

无表面活性剂存在下，用PE或CL酰基衍生物对蛋白质进行疏水化，再将其插入REV脂质体153

蛋白质固定于含有NGPE的预制脂质体表面155

将水溶性多肽共价偶联到脱水-再水化脂质体上155

脂质体的高碘酸盐偶联法156

N-PDP-PE的合成158

蛋白质的巯基化（以IgG为例说明）159

影响偶联反应效率的因素160

SAMSA/SATA修饰蛋白质164

将碳水化合物（糖）或其他小分子结合于脂质体表面166

将糖衍生物共价偶联于预制含NGPE的脂质体167

脂质体结合糖的定量分析168

将诊断用金属原子连接于脂质体表面168

DTPA二硬脂酰酯的制备169

DTPA二硬脂酰硫酯的制备169

DTPA二硬脂酰胺的制备（在V.P.T.实验室完成）170

DTPA磷脂酰乙醇胺（DTPA-PE）的制备170

另一制备DTPA-PE的方法（在V.P.T.实验室完成）171

多螯合聚合物的制备171

在DTPA硬脂酰胺（DTPA-SA）上负载Gd172

在DTPA硬脂酰酯（DTPA-SE）上负载Gd174

在DTPA-PLL-NGPE上负载Gd（在V.P.T.实验室完成）174

在含DTPA的脂质体上负载Gd174

在含DTPA的脂质体上负载99mTc175

用111In标记含螯合剂的脂质体（在V.P.T.实验室完成）175

空间保护聚合物（PEG）与脂质体相连接179

用PEG羟基琥珀酰亚胺酯制备PEG-PE180

用PEG琥珀酸酯合成PEG-PE180

用羰二咪唑合成PEG-PE181

合成PEG-琥珀酸半胱酰胺，与含有间-马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯DPPE衍生物（MBPE）的预制脂质体表面连接181

不同配体与脂质体中接技聚合物的远端相连184

PE-PEG-酰肼（PEG-PE-Hz）的合成188

将氮端为Ser或Thr的肽连接到脂质体中PE-PEG-Hz远端的酰肼基上189

将经高碘酸氧化的抗体与含有Hz-PEG-PE的脂质体相连接190

PDP-PEG-PE的合成190

马来酰亚胺丁酸苯酯-抗体（MPB-Ab）的合成191

抗体与含有PDP-PEG-PE的脂质体相连接192

顺丁烯二酰亚胺-PEG-PE的合成192

COOH-PEG-PE的合成193

抗体与含有COOH-PEG-PE的脂质体相连194

配体与pNP-PEG-PE相连195

低聚糖（SLX）-PEG-DSPE的合成196

Sialyl Lewisx(SLX)-PEG-DSPE的合成196

寡肽（YIGSR）-PEG-DSPE的合成197

氨基-PEG-DSPE的合成199

叶酸-PEG2000-DSPE的合成200

生物素-PEG-DSPE的合成201

通过将混有配体脂质聚合物的脂质水化并挤出制备携有配体的脂质体（PHPC/胆固醇／mPEG-DSPE／配体-PEG-DSPE，物质的量比55∶40∶3∶2）202

将配体-PEG-DSPE插入到预制脂质体中202

脂质体表面上可解离的PEG203

制备带有可解离PEG包衣的pH敏感脂质体203

脂质体与细胞的相互作用208

培养细胞对脂质体的结合和摄取211

用胶原蛋白酶灌注法分离和纯化肝实质细胞、枯否细胞和内皮细胞214

由大鼠肝分离的肝实质细胞、枯否细胞和内皮细胞的培养216

脂质体的生物学分布217

从血清中重新分离脂质体218

大鼠体内脂质体组织分布的测定220

大鼠器官内脂质体分布的定性测定221

质粒DNA的分离230

氯化铯离心法分离质粒DNA230

质粒DNA浓度的定量231

Hoechst荧光分析232

紫外分光光度法测定质粒DNA的浓度232

脂质转染（Lipofection）233

方法242

逆相蒸发-挤出法制备FITC-右旋糖酐pH敏感脂质体（DOPE/CHEMS,3∶2，物质的量之比，50mmol/L脂质，2mL）242

采用冻融-挤出法制备HPTS或HPTS/DPX pH敏感脂质体（DOPE/CHEMS,3∶2物质的量之比；50mmol/L脂质，1mL）243

pH敏感脂质体的稳定性244

用显微技术或流式细胞仪分析研究pH敏感脂质体与细胞的结合245

pH敏感脂质体的胞吞作用246

γ-发射放射性核素标记脂质体的方法252

谷胱甘肽-HMPAO后装法99mTc标记脂质体254

图像采集和分析方法257

动物静脉注射放射标记脂质体后的成像研究258

以γ井型计数器测定组织生物学分布260

放射标记脂质体静脉注射后在动物体内的组织生物学分布研究260

临界胶束浓度的评价268

表面活性剂的恒温微量滴定——CMC的测定269

数据分析269

表面活性剂-双分子层膜平衡270

表面活性剂向膜内的分配273

脂质体增溶274

囊泡型磷脂凝胶的制备278

用单一脂质制备VPG278

用两种或多种脂质制备VPG279

VPG的载药280

亲水性化合物（吉西他滨）在VPG中的被动载药280

VPG的表征282

VPG药物的体外释放评价283

由VPG制备SUV分散体284

VPG转变为脂质体分散体284

采用脱水-再水化法将质粒DNA包封于脂质体中292

MLV和SUV的制备293

脂质体包封质粒DNA293

DNA包封率的评价294

减少包封DNA的DRV脂质体粒径295

Ⅰ 一般方法　1

第1章　脂质体的制备3

1.1　磷脂的处理及贮存3

1.2　制备方法3

1.2.1　手摇法3

1.2.2　超声法5

1.2.3　冻干再水化法7

1.2.4　逆相蒸发法8

1.2.5　表面活性剂去除法10

1.2.6　高压均质法13

1.3　脂质体的纯化19

1.3.1　柱过滤19

1.3.2　离心法纯化脂质体19

参考文献22

第2章　脂质体的表征24

2.1 引言24

2.2　脂质体组分的化学分析25

2.2.1　分光光度法对磷脂进行定量分析25

2.2.2　脂质的薄层色谱28

2.2.3　（磷）脂的HPLC分析30

2.2.4　胆固醇和α-生育酚的HPLC分析32

2.2.5　脂肪酸的GLC分析33

2.2.6　脂质体磷脂降解的化学分析35

2.3　脂质体的物理表征40

2.3.1　包封百分比的测定40

2.3.2　释放率的测定43

2.3.3　包封体积的测定51

2.3.4　层状结构51

2.3.5　脂质体的粒径测定53

2.3.6 PCS测定zeta电势57

2.4　其他方法57

2.4.1　Bligh和Dyer萃取法57

2.4.2　Sep-Pak微柱萃取58

2.4.3　羧基荧光素和钙黄绿素溶液的制备59

参考文献60

第3章 物理研究方法：差示扫描量热法62

3.1 引言62

3.2　技术概述62

3.2.1　差示扫描量热法62

3.2.2　高灵敏度差示扫描量热法64

3.2.3　调制温度差示扫描量热法64

3.3　DSC测量的实际问题66

3.3.1　坩埚的选择66

3.3.2　样品量66

3.3.3　校准66

3.3.4　扫描速率67

3.3.5　研究脂质体要求的条件67

3.3.6　HSDSC测量的实际应用69

3.3.7　MTDSC测量实例70

3.4　DSC及相关技术在脂质体研究中的应用71

3.4.1　脂质体的相转变行为71

3.4.2　多组分体系的相转变73

3.4.3　磷脂-药物的相互作用75

3.4.4　脂质体作为膜模型的DSC研究77

3.4.5　冻干脂质体的MTDSC研究78

致谢78

参考文献79

第4章　脂质体研究中的荧光分析法81

4.1　荧光分析法研究脂质体融合81

4.1.1　铽／二吡啶羧酸分析法研究水性内容物的混合81

4.1.2　水性内容物混合的氨基萘三磺酸／对-二甲苯二溴化吡啶（ANTS/DPX）分析87

4.1.3　NBD／罗丹明共振能量转移法分析脂质混合88

4.1.4　荧光分析测定内侧单分子层的混合90

4.2　荧光分析法研究脂质体的渗透性92

4.2.1　羧基荧光素或钙黄绿素的释放92

4.2.2　Tb/DPA复合物的释放92

4.2.3　ANTS/DPX的释放92

4.3　荧光法检测蛋白质与磷脂膜的结合93

4.3.1　通过膜结合的荧光团检测93

4.3.2　用膜内蛋白缔合的荧光团检测95

4.4　脂质体作为pH传感器研究细胞相互作用97

4.4.1 Pyranine（HPTS）分析法98

4.4.2　双荧光团分析102

4.5　双光子激发荧光显微法检测巨大型脂质体中的脂质相104

4.5.1　直接观察双分子层中脂质区域共存104

4.5.2　巨大型单层脂质体104

4.5.3　双光子激发显微法106

4.5.4　二元磷脂混合物中凝胶相／液相共存的观察108

致谢110

参考文献111

第5章　脂质体的稳定性、贮存及灭菌115

5.1 引言115

5.2　防止化学降解115

5.2.1　磷脂氧化115

5.2.2　磷脂的水解117

5.3　防止物理变化119

5.4　脂质体的冻干120

5.4.1 引言120

5.4.2　脂质体冻干的重要因素120

5.4.3　冻干状态的稳定性124

5.4.4　冻干方案示例125

5.5　无菌脂质体制剂的制备126

参考文献127

第6章 用大单室囊泡包封弱碱性药物、反义寡核苷酸和质粒DNA递送药物129

6.1 引言129

6.2　磷脂浓度的测定130

6.3　用确定孔径的聚碳酸酯膜挤出制备大单室脂质体132

6.4　弱碱性药物基于跨膜pH梯度在LUV中积聚133

6.5 包封基因药物的脂质体系统：用于体内递送基因和反义寡核苷酸的长循环载体140

参考文献145

第7章　脂质体的表面修饰149

7.1 引言149

7.2　蛋白质和多肽连接到脂质体表面149

7.2.1　蛋白质和多肽通过氨基与脂质体结合150

7.2.2　通过巯基将蛋白质连接到脂质体上157

7.3　将碳水化合物（糖）或其他小分子结合于脂质体表面166

7.4　将诊断用金属原子连接于脂质体表面168

7.4.1　低分子质量螯合物DTPA与脂质相连，从而插入脂质体膜169

7.4.2　在与脂质体结合的螯合物上负载金属172

参考文献175

第8章 空间保护型长循环脂质体178

8.1 引言178

8.2　空间保护聚合物（PEG）与脂质体相连接179

8.2.1　脂质体中插入PEG179

8.2.2　在预制的脂质体上连接PEG181

8.2.3　长循环脂质体的体内分布对其粒径的依赖性182

8.2.4　长循环脂质体在肿瘤组织中的蓄积182

8.3　不同配体与脂质体中接枝聚合物的远端相连184

8.3.1　配体与肼化PEG相连188

8.3.2　配体与PDP活化的PEG相连190

8.3.3 通过COOH-活化的PEG连接配体193

8.3.4　将含有伯氨基的配体与含有pNP-PEG-PE的脂质体相连194

8.3.5　制备“配体-PEG-脂质”结合物并将其插入脂质体中196

8.4　脂质体表面上可解离的PEG203

8.5　对PEG化脂质体的消除有影响作用的生物因素204

参考文献205

第9章 生物系统中的脂质体208

9.1 引言208

9.2　脂质体与细胞的相互作用208

9.2.1　脂质体细胞相互作用的可能方式：吸附、（受体介导的）胞吞作用、脂质交换、融合208

9.2.2　标记物210

9.2.3　细胞系和原代细胞培养210

9.2.4　肝细胞的分离及培养212

9.3　脂质体的生物分布217

9.3.1　动物模型／种属差异217

9.3.2　体内脂质体-细胞相互作用218

9.3.3　标记物219

9.3.4　脂质体的动力学及组织分布219

致谢222

参考文献222

第10章 基因递送中的阳离子脂质体225

10.1 引言225

10.2　质粒DNA的分离230

10.3　质粒DNA浓度的定量231

10.4　N/P比的计算234

参考文献234

Ⅱ 专题和应用　235

第11章　pH敏感脂质体237

11.1 引言237

11.2　pH敏感的机理238

11.3　方法242

11.3.1　pH敏感脂质体的制备242

11.3.2　pH敏感脂质体的表征244

11.3.3　pH敏感脂质体的细胞结合245

参考文献246

第12章 放射标记脂质体用于造影和生物学分布研究249

12.1 引言249

12.2　用于追踪放射标记脂质体的仪器249

12.2.1 γ射线照相机249

12.2.2 正电子发射断层成像照相机250

12.2.3 γ井型计数器251

12.3 γ-发射放射性核素标记脂质体的方法252

12.3.1　概述252

12.3.2　用于标记脂质体的放射性核素252

12.3.3　放射性核素标记脂质体的方法253

12.4　放射标记脂质体的表征256

12.4.1　放射标记体外稳定性评价256

12.4.2　体内放射标记评价257

12.5　图像采集和分析方法257

12.6　以γ井型计数器测定组织生物学分布260

参考文献261

第13章 恒温滴定量热法（ITC）263

13.1 引言263

13.2　仪器和技术原理264

13.3　MCS ITC的计算机辅助测量265

13.3.1　热力滴定265

13.4　临界胶束浓度的评价268

13.4.1　热动力学背景268

13.4.2　测量269

13.5　表面活性剂-双分子层膜平衡270

13.5.1　表面活性剂分配进入脂质膜270

13.5.2　脂质体增溶273

参考文献275

第14章 囊泡型磷脂凝胶（VPG）276

14.1 背景276

14.1.1　静注用脂质体面临的生物药剂学和技术上的挑战276

14.1.2　局部给药脂质体面临的生物药剂学和技术上的挑战276

14.1.3　磷脂分散体：溶胀和相277

14.1.4　机械应力：囊泡分散体和囊泡型磷脂凝胶的形成277

14.1.5　VPG的概念277

14.2 VPG的制备278

14.2.1　用单一磷脂制备VPG278

14.2.2　用两种或多种脂质制备VPG279

14.3　VPG载药280

14.3.1　直接包封280

14.3.2　被动载药280

14.3.3　掺入／结合281

14.4 VPG的灭菌281

14.5 VPG的表征282

14.5.1 形态282

14.5.2　流变学、黏性282

14.5.3　体外的缓释行为282

14.6 由VPG制备SUV分散体284

14.7 由VPG制备的SUV分散体的表征285

14.7.1　囊泡粒径分布285

14.7.2　包封率285

14.8　体内应用286

14.8.1　吉西他滨VPG的制备和体外表征286

14.8.2　肿瘤内注射吉西他滨VPG287

14.8.3　静注吉西他滨VPG287

参考文献289

第15章 脂质体DNA疫苗：包封操作291

15.1 引言291

15.2　材料292

15.3 采用脱水-再水化法将质粒DNA包封于脂质体中292

15.3.1　溶液的配制292

15.3.2　操作步骤292

参考文献297

附录298

索引306