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第1章 如何在分子水平研究生命1

1.1 生物化学与分子生物学实验技术的发展简史1

1.2 生物化学与分子生物学实验技术的完整体系4

1.2.1 对生物分子进行分析鉴定4

1.2.2 对生物分子进行人工合成4

1.2.3 对生物分子进行人工改造5

1.2.4 对生物分子进行功能研究6

1.3 生物化学与分子生物学实验技术的广泛应用6

1.3.1 电泳技术在临床检验中的应用7

1.3.2 DNA重组技术在医药卫生领域的扩展7

1.3.3 基因诊断和治疗技术在未来医学领域的前景8

1.3.4 动物模型在医学研究中的重要地位8

第2章 从组织中分离纯化生物高分子——高分子制备技术10

2.1 预处理和细胞的分离11

2.1.1 选择材料及预处理11

2.1.2 细胞的分离11

2.2 细胞破碎及细胞器分离11

2.2.1 细胞破碎11

2.2.2 细胞器的分离13

2.3 分离与纯化13

2.3.1 蛋白质的分离纯化13

2.3.2 核酸的分离纯化14

2.3.3 蛋白质浓度的测定15

2.3.4 核酸的浓度、纯度测定和完整性鉴定17

2.4 生物高分子提纯后的处理18

2.4.1 样品的浓缩18

2.4.2 样品的干燥18

2.4.3 样品的保存19

2.5 实验项目——蛋白质的盐析与透析20

第3章 测定物质的吸收光谱——分光光度技术22

3.1 分光光度技术的基本原理22

3.1.1 光的性质22

3.1.2 光谱23

3.1.3 Lambert-Beer定律24

3.2 分光光度计的基本结构25

3.2.1 光源26

3.2.2 分光系统26

3.2.3 样品室27

3.2.4 检测器27

3.2.5 显示器28

3.3 常用分光光度计的使用方法28

3.3.1 721e型分光光度计28

3.3.2 722s型分光光度计28

3.3.3 Sp-756紫外可见分光光度计29

3.4 分光光度技术的应用29

3.4.1 溶液的定性分析29

3.4.2 溶液的定量分析30

3.5 实验项目30

3.5.1 蛋白质的定量测定30

3.5.2 脲酶Km值测定34

3.5.3 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法）36

3.5.4 血糖的定量测定——葡萄糖氧化酶法39

3.5.5 激素对血糖浓度变化的影响40

3.5.6 血浆高密度脂蛋白-胆固醇的测定41

3.5.7 紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度43

第4章 将混合物中各种组分分开——层析技术44

4.1 层析技术的形成和发展44

4.2 层析技术概述45

4.2.1 层析技术的基本原理45

4.2.2 层析技术的分类45

4.2.3 层析技术的基本要求46

4.3 吸附层析46

4.3.1 吸附层析的原理46

4.3.2 吸附层析的操作46

4.4 分配层析48

4.4.1 纸层析的原理48

4.4.2 纸层析的操作49

4.5 凝胶过滤层析50

4.5.1 凝胶过滤层析的原理50

4.5.2 凝胶过滤层析的特征常数51

4.5.3 凝胶过滤层析的常用介质51

4.5.4 凝胶过滤层析的操作52

4.5.5 凝胶过滤层析的应用53

4.6 离子交换层析53

4.6.1 离子交换层析的原理54

4.6.2 离子交换剂54

4.6.3 离子交换层析的操作55

4.6.4 离子交换层析的应用57

4.7 亲和层析57

4.7.1 亲和层析的原理58

4.7.2 亲和层析的操作58

4.8 实验项目59

4.8.1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法59

4.8.2 转氨酶的活性鉴定——薄层层析法60

4.8.3 核苷酸的分离——离子交换柱层析法62

4.8.4 胰蛋白酶的分离纯化——亲和层析法63

4.8.5 血清蛋白质的层析分离——分子筛层析法64

第5章 分离带电粒子的有效手段——电泳技术66

5.1 电泳技术的形成和发展66

5.2 电泳技术的基本原理66

5.3 影响泳动率的因素67

5.3.1 溶液的pH67

5.3.2 缓冲液的离子强度68

5.3.3 电场强度68

5.3.4 电渗作用69

5.4 电泳技术的种类69

5.4.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳69

5.4.2 凝胶电泳70

5.4.3 等电聚焦电泳72

5.4.4 双向电泳73

5.4.5 核酸电泳74

5.4.6 印迹转移电泳75

5.5 实验项目76

5.5.1 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳76

5.5.2 血清乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳78

5.5.3 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳79

5.5.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量80

5.5.5 DNA琼脂糖凝胶电泳83

5.5.6 限制性内切酶对质粒DNA酶切产物的电泳鉴定84

第6章 利用离心场沉降高分子——离心技术86

6.1 离心技术的基本原理86

6.1.1 颗粒沉降的原理86

6.1.2 沉降系数87

6.1.3 相对离心力87

6.2 离心机的类型和操作规程87

6.2.1 离心机的类型87

6.2.2 制备型离心机88

6.2.3 分析型离心机90

6.3 制备性超速离心的分离方法90

6.3.1 差速沉降离心法91

6.3.2 密度梯度区带离心法91

6.3.3 等密度梯度区带离心法91

6.4 离心机操作的注意事项91

6.5 实验项目92

6.5.1 肝糖原的提取和鉴定92

6.5.2 酪蛋白的制备94

6.5.3 动物肝脏DNA的提取95

6.5.4 酵母RNA的提取及成分鉴定96

6.5.5 质粒DNA的提取与鉴定98

6.5.6 感受态细菌的制备及质粒DNA的转化102

第7章 利用碱基互补探查核酸序列——分子杂交技术105

7.1 核酸分子杂交的基本原理105

7.1.1 变性与复性105

7.1.2 建立在DNA变性与复性基础上的核酸杂交技术106

7.2 核酸探针的分类和标记107

7.2.1 核酸探针的分类107

7.2.2 核酸探针的标记108

7.3 核酸分子杂交技术110

7.3.1 固相杂交的支持物110

7.3.2 常用的转移方法111

7.3.3 固相杂交的基本程序111

7.4 主要的杂交类型112

7.4.1 Southern杂交112

7.4.2 Northern杂交112

7.4.3 组织原位杂交113

7.4.4 斑点杂交113

7.5 实验项目113

7.5.1 Southern杂交113

7.5.2 Northern杂交115

7.5.3 组织原位杂交116

7.5.4 斑点杂交118

第8章 微量DNA体外扩增——PCR技术120

8.1 PCR技术的产生与发展120

8.1.1 PCR技术的产生120

8.1.2 PCR新技术的发展121

8.2 PCR技术基础123

8.2.1 PCR技术的基本原理123

8.2.2 PCR技术的特点124

8.2.3 PCR反应体系中的基本成分124

8.2.4 PCR的反应参数128

8.2.5 常规PCR反应129

8.2.6 PCR反应条件的优化130

8.2.7 PCR产物的检测分析130

8.3 PCR技术的应用131

8.3.1 PCR技术在分子生物学中的应用131

8.3.2 PCR技术在传染病病原体检测中的应用131

8.3.3 PCR技术在肿瘤相关基因检测的应用132

8.3.4 PCR技术在遗传病早期诊断的应用132

8.4 PCR的衍生技术132

8.4.1 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）132

8.4.2 实时荧光定量PCR136

8.5 实验项目——聚合酶链式反应（PCR）体外扩增DNA142

第9章 阅读遗传天书的第一步——测序技术145

9.1 DNA序列测定的基本原理145

9.2 DNA测序方法145

9.2.1 酶学法——双脱氧链终止法146

9.2.2 化学（裂解）法——Maxam-Gilbert测序法148

9.2.3 双脱氧测序法和化学测序法的选择149

9.3 DNA测序自动化和大规模测序151

第10章 建立转基因动物模型——转基因技术153

10.1 转基因动物154

10.2 转基因的原理和方法155

10.2.1 转基因动物技术的基本体系155

10.2.2 建立转基因动物的方法155

10.3 基因敲除小鼠和基因敲入小鼠162

10.3.1 基因敲除小鼠162

10.3.2 基因敲入小鼠162

10.4 转基因动物的应用163

10.4.1 研究基因的结构和功能及其表达与调控163

10.4.2 建立人类疾病动物模型163

10.4.3 研究人类疾病基因治疗163

10.4.4 利用转基因动物生产生物活性蛋白164

10.4.5 利用转基因动物生产人用器官移植的供体164

10.4.6 利用转基因技术改良动物品种和生产性能164

10.5 转基因安全性问题165

10.5.1 转基因生物的环境安全性165

10.5.2 转基因食品的安全性166

第11章 去除动物体内某种基因——基因敲除技术167

11.1 基因敲除技术的建立和发展167

11.2 基因敲除的原理和基本方法168

11.3 基因敲除小鼠的制备过程171

11.4 基因敲除的其他方法及进展175

11.4.1 条件性基因敲除法175

11.4.2 诱导性基因敲除法176

11.4.3 利用随机插入突变进行基因敲除177

11.5 基因敲除技术的应用及前景179

11.5.1 建立生物模型179

11.5.2 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗179

11.5.3 提供廉价的异种移植器官179

11.5.4 免疫学中的应用180

11.5.5 改造生物、培育新的生物品种180

11.6 基因敲除技术的缺陷180

第12章 21世纪的生命科学技术——蛋白质组学技术181

12.1 蛋白质组学概论181

12.2 蛋白质组学研究的策略和范围183

12.3 蛋白质组学的技术183

12.3.1 蛋白质组研究中的样品制备184

12.3.2 蛋白质组研究中的样品分离技术185

12.3.3 蛋白质组研究中的样品鉴定技术190

12.4 蛋白质组生物信息学196

12.5 蛋白质组学发展趋势196

12.6 实验项目197

12.6.1 家兔血清蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立197

12.6.2 正常人尿蛋白质组学研究198

第13章 蛋白质与核酸相互作用分析——EMSA和ChIP技术200

13.1 电泳迁移阻滞实验的基本原理200

13.2 染色质免疫沉淀技术的基本原理200

13.3 EMSA的基本操作步骤201

13.3.1 探针的选择201

13.3.2 探针的标记与纯化201

13.3.3 核酸结合蛋白的制备202

13.3.4 蛋白质与寡核苷酸探针的结合反应202

13.3.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备202

13.3.6 预电泳和电泳202

13.3.7 检测203

13.4 ChIP技术的基本操作步骤203

13.4.1 蛋白质与DNA交联203

13.4.2 染色质DNA的剪切203

13.4.3 免疫沉淀203

13.4.4 洗脱和纯化与蛋白结合的DNA204

13.4.5 DNA分析204

13.5 实验项目204

13.5.1 经EMSA验证姜黄素可减少B淋巴细胞核中NF-kB的量204

13.5.2 经ChIP验证姜黄素可减少B淋巴细胞核中NF-kB的量207

第14章 蛋白质和蛋白质相互作用分析——酵母双杂交等技术211

14.1 概述211

14.1.1 相互作用蛋白质组学211

14.1.2 相互作用蛋白质组学的研究目标212

14.1.3 相互作用蛋白质组学的研究内容和主要技术213

14.2 酵母双杂交技术214

14.2.1 酵母双杂交系统的原理214

14.2.2 酵母双杂交系统的应用215

14.2.3 酵母细胞内的高通量酵母双杂交215

14.2.4 酵母双杂交系统的几个版本216

14.2.5 酵母双杂交系统的假阳性问题216

14.3 其他常用技术216

14.3.1 细菌双杂交系统216

14.3.2 噬菌体展示技术218

14.3.3 依赖于亲和力筛选相互作用蛋白质的方法218

14.3.4 蛋白质芯片技术219

14.4 实验项目219

14.4.1 经酵母双杂交技术筛选TRAC-1相互作用蛋白质219

14.4.2 GST融合蛋白沉降技术筛选RNF114相互作用蛋白质225

第15章 科学发展的不竭源泉——技术创新228

15.1 “三性”实验228

15.1.1 “三性”实验的概念228

15.1.2 “三性”实验的特点和意义228

15.1.3 实验教学体系的改革229

15.1.4 “三性”实验基本要求230

15.1.5 “三性”实验的一般程序230

15.1.6 “三性”实验选题原则要求230

15.1.7 “三性”实验的评估及实施231

15.2 实验项目231

15.2.1 酵母蔗糖酶的纯化及性质研究231

15.2.2 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定237

15.2.3 DNA重组实验240

第16章 确保实验技术的最佳效果——实验室管理248

16.1 实验室规则248

16.2 实验用品的清洗249

16.2.1 玻璃仪器的洗涤249

16.2.2 塑料器皿的洗涤250

16.2.3 实验器皿的干燥与消毒250

16.2.4 常用洗涤液及其配制250

16.3 实验标本的制备251

16.3.1 血液样品的制备和保存251

16.3.2 尿液标本的收集与保存252

16.3.3 组织样品的制备与保存252

16.4 实验仪器的使用253

16.4.1 刻度吸管的使用253

16.4.2 微量进样器的使用253

16.4.3 单道可调式移液器的使用254

16.4.4 蒸汽压力灭菌器的使用254

16.4.5 酸度计的使用255

16.4.6 干燥箱和恒温箱的使用256

16.4.7 电热恒温水浴锅的使用257

16.5 实验数据的处理257

16.5.1 列表法258

16.5.2 作图法258

16.5.3 少量实验数据的处理259

16.5.4 实验误差和提高实验准确度的方法259

16.6 实验报告的书写261

16.6.1 实验记录261

16.6.2 实验报告261

16.7 常用实验数据262

16.7.1 一般化学试剂的分级及配制的注意事项262

16.7.2 实验室中常用酸碱的比重和浓度264

16.7.3 常用缓冲溶液264

16.7.4 溴化乙锭溶液的净化处理270

16.7.5 离心机转数（r/min）与相对离心力（RCF）的换算271

16.7.6 硫酸铵饱和度的常用表271

16.7.7 元素原子量表273

参考文献275