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第一编 DNA病毒重组技术研究实例3

第1章 绪论3

1.1 伪狂犬病病毒的分子生物学研究进展4

1.2 重组伪狂犬病病毒活载体研究进展9

1.3 重组伪狂犬病毒的筛选13

1.4 重组伪狂犬病毒的评价14

1.5 猪传染性胃肠炎病毒S基因分子生物学研究进展15

1.6 猪传染性胃肠炎病毒发病机理与免疫机制19

1.7 猪传染性胃肠炎的防治20

1.8 猪传染性胃肠炎病毒疫苗研究现状21

1.9 重组活载体疫苗及其研发原则23

第2章 转移载体pUGS-LacZ的构建27

2.1 含PrV PK（部分）和gG基因的重组质粒pUG的构建27

2.2 含TGEV Sa基因和SV40 PolyA序列的重组质粒pHSV的构建33

2.3 表达TGEV S基因主要抗原位点的PrV转移载体构建38

2.4 小结41

第3章 重组伪狂犬病病毒的获得46

3.1 转移载体pUGS-LacZ质粒的提取46

3.2 PrV/Bartha K-61基因组的提取47

3.3 转移载体与Bartha K-61基因组的共转染48

3.4 小结49

第4章 重组病毒rPrV-TGEV-S1的筛选、纯化和鉴定51

4.1 重组病毒rPrV-TGEV-S1的筛选和纯化51

4.2 重组病毒rPrV-TGEV-S1的PCR鉴定51

4.3 小结55

第5章 重组病毒rPrV-TGEV-S1中S1片段的表达检测57

5.1 Western boltting检测57

5.2 间接免疫荧光检测58

5.3 小结59

第6章 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在毒种特性上的比较61

6.1 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在不同细胞上的毒价和病变形态的比较61

6.2 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在穿人能力上的比较63

6.3 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株一步生长曲线的比较63

6.4 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在理化性质上的比较64

6.5 小结65

第7章 重组病毒rPrV-TGEV-S1接种BALB/C小鼠实验68

7.1 实验动物分组68

7.2 腹腔免疫实验68

7.3 鼻腔免疫实验68

7.4 免疫小鼠血清抗体检测69

7.5 免疫小鼠鼻腔灌洗物与肠黏液的抗体检测71

7.6 免疫小鼠乳汁中的抗体检测72

7.7 免疫小鼠血清的中和抗体实验73

7.8 小结75

第二编 RNA病毒突变技术研究实例81

第8章 绪论81

8.1 EIAV认知历史和现状84

8.2 EIAV的生物学特性85

8.3 EIAV的分子生物学87

8.4 EIAV基因非编码区LTR相关研究进展95

8.5 EIAV主要基因的变异研究进展101

8.6 EIAV的免疫学研究进展105

8.7 中国EIA弱毒疫苗及相关研究进展111

8.8 慢病毒与糖基化116

8.9 本研究的目的和意义121

第9章 强弱毒包含完整S2和gp90及部分gp45基因的扩增122

9.1 驴白细胞的培养122

9.2 EIAV病毒RNA的提取及基因扩增122

9.3 小结135

第10章 EIAVFDDV N-连接糖基化回复突变感染性克隆的构建139

10.1 pMD18-Tg5,pMD18-Tg9,pMD18-Tg10,pMD18-Tg5g9,pMD18-Tg5g10,pMD18-Tg9g10,pMD18-Tg5g9g10突变克隆的构建139

10.2 pLGFDg5,pLGFDg9,pLGFDg10,pLGFDg5g9,pLGFDg5g10,pLGFDg9g10,pLGFDg5g9g10突变克隆的构建144

10.3 小结147

第11章 转染及感染性150

11.1 质粒的提取和纯化150

11.2 质粒在细胞培养中的转染和传代152

11.3 转染传代后细胞培养物中EIAV的检查156

11.4 嵌合病毒复制动力学分析163

11.5 病毒与抗血清的中和实验167

11.6 小结169

附录172

附录A 转移载体pUG-LacZ构建流程图172

附录B 转移载体pUG-LacZ与亲本病毒Bartha K-61同源重组后外源基因插入示意图173

附录C 实验材料174

附录D 马克隆EIAV强毒（EIAVL）env基因gp90的核苷酸序列177

附录E 实验材料197

参考文献200