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目录1

绪言1

一、细胞与细胞培养1

二、细胞培养的发展史2

三、细胞生物学与培养细胞学3

四、培养细胞学的研究内容4

五、培养细胞学的常用术语6

第一篇　导论9

第一章　培养细胞生物学9

第一节　组织来源与培养9

二、正常或肿瘤组织来源10

一、胚胎或成体组织来源10

三、培养细胞的生长与增殖11

第二节　器官培养物的分化与发育13

一、培养环境对细胞分化的作用14

二、组织细胞间的相互作用15

三、诱导物与肿瘤细胞间的相互作用15

四、病毒、致癌剂和分化16

第三节　培养细胞的遗传学特征16

一、培养细胞的遗传学16

二、细胞遗传学检测技术及应用17

第四节　细胞系或细胞株的建立18

一、基本概念18

二、建立细胞系（株）的鉴定要求19

三、建立细胞系（株）的鉴定结论21

第二章　细胞培养的基本条件23

第一节　实验室设计及设备器材23

一、细胞培养室设计原则及要求23

二、设备器材24

第二节　实验器材的处理25

一、清洗25

二、包装27

三、消毒灭菌27

第三节　培养用液29

一、细胞培养对水的要求29

二、平衡盐溶液30

三、细胞培养常用试剂32

四、常用培养液34

五、培养液的选择与应用37

第三章　基本技术38

第一节　无菌技术38

第二节　标本材料的选择和处理39

第三节　细胞的制备39

一、单细胞悬液的制备39

二、细胞分离法40

三、细胞计数法41

四、细胞活性的检查41

五、细胞的分装41

第五节　细胞形态学检查法42

一、利用倒置显微镜观察细胞的形态和结构42

第四节　细胞培养与传代42

二、利用荧光显微镜观察细胞的形态和结构45

三、利用电子显微镜观察细胞的形态和结构47

第六节　无血清培养液的设计和合成51

一、实验原理51

二、无血清培养液的设计方法52

三、配制方法52

第七节　细胞的冻存、复苏与运输54

一、细胞的冻存54

二、细胞的复苏55

三、细胞的运输56

第八节　细胞培养的放大试验（生产）56

一、细胞培养时污染的检测57

第九节　细胞培养时污染的检测、排除57

二、微生物污染的排除60

第二篇　细胞培养技术61

第四章　动物细胞培养61

第一节　概述61

第二节　禽类动物细胞培养62

一、鸡胚成纤维细胞的制备和培养62

二、鸡胚神经细胞培养法62

三、鸡胚心脏块的制备与培养64

第三节　啮齿类动物细胞培养65

一、小鼠乳腺上皮细胞的制备与培养65

二、小鼠骨髓细胞的制备与培养67

三、大鼠肝细胞培养法68

四、新生大鼠心脏细胞的制备与培养70

五、成年大鼠心室肌肉细胞的制备与培养72

六、大鼠胰岛细胞培养法73

第四节　兔细胞培养76

一、新生兔肾细胞的制备与培养76

二、新生兔软骨细胞培养法77

三、兔胚动脉平滑肌细胞的制备与培养78

四、兔胚气管上皮的制备与培养80

第五节　动物血管内皮细胞的制备与培养81

第五章　人细胞培养87

第一节　人胚肾细胞的制备与培养87

第二节　人胚肺二倍体细胞的制备与培养88

第三节　人表皮角质形成细胞及真皮成纤维细胞的培养89

第四节　人血管内皮细胞的制备与培养90

第五节　淋巴细胞的分离培养与分化92

一、基本原理92

二、淋巴细胞的分离和激化93

三、EB病毒转化淋巴细胞94

第六节　人支气管上皮细胞的原代培养95

第六章　干细胞的培养97

第一节　饲养层细胞与条件培养液的制备97

一、小鼠胚胎成纤维细胞的培养和制备97

二、小鼠成纤维细胞系STO饲养板的制备98

第二节　胚胎干细胞的培养99

一、小鼠胚胎干细胞的分离与培养99

二、鸡胚干细胞的培养与体外分化101

三、猪胚胎干细胞的分离与培养102

四、人胚脑组织干细胞的直接分离和培养103

第三节　成体干细胞的培养104

一、成体神经干细胞的培养及诱导分化104

二、间充质干细胞的培养105

三、表皮组织干细胞的培养108

第四节　胚胎干细胞的建系109

一、胚胎干细胞分离材料的获取与处理109

二、胚胎干细胞的分化抑制培养109

三、胚胎干细胞的生物学性状与鉴定111

四、胚胎干细胞系的建立与保存112

第一节　肿瘤细胞培养技术115

第七章　肿瘤细胞的培养115

第二节　肿瘤细胞的原代培养116

第三节　体外培养肿瘤细胞的生物学检测117

一、核型分析117

二、软琼脂培养118

三、异体动物接种法118

第四节　肿瘤细胞的建株118

第五节　常见肿瘤细胞的传代与保存119

一、常见肿瘤细胞的传代119

二、肿瘤细胞的保存120

第三篇　培养细胞学研究123

第八章　培养细胞的分析123

第一节　细胞融合123

一、病毒诱导细胞融合法124

二、聚乙二醇诱导细胞融合法125

三、电诱导细胞融合法126

第二节　细胞同步化法127

第三节　细胞克隆129

一、细胞克隆培养技术129

二、影响克隆形成率的因素131

第四节　培养细胞的转化133

第五节　细胞凋亡136

一、原理136

二、细胞凋亡的形态学检测法137

三、细胞凋亡的生物化学检测法138

四、诱导细胞凋亡的免疫化学检测法140

五、bcl-2基因的抗凋亡作用141

第六节　流式细胞分选术142

第七节　细胞酶活性测定145

一、酸性磷酸酶145

二、葡萄糖-6-磷酸酶146

三、琥珀酸脱氢酶147

四、DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法148

五、DNA的孚尔根染色法148

第九章　亚细胞器的分离150

第一节　细胞膜的分离151

第二节　微粒体的分离151

第三节　线粒体的分离154

一、原理155

第四节　核糖体、核糖体亚基和多核糖体的分离和纯化155

二、动物细胞核糖体、多核糖体及核糖体亚基的分离156

三、细菌核糖体制备及大、小亚基的分离157

第五节　RNA的提取159

第六节　RNA的Northern杂交分析162

第七节　细胞核、核仁的分离和纯化164

第八节　高尔基体的分离和分析166

第十章　细胞器蛋白质和基因的显示169

第一节　免疫荧光显微术169

一、荧光显微镜及其附属设备169

二、抗体标记170

三、荧光染料171

第二节　用酶标法检测细胞内蛋白质的定位172

第三节　核蛋白的免疫荧光定位175

一、原理175

二、直接免疫荧光法测抗原175

三、间接免疫荧光法测抗体176

第四节　比较基因组杂交177

第五节　荧光标记染色体原位杂交179

第六节　RNA原位杂交182

第四篇　培养细胞信息学研究185

第十一章　细胞信息的传递与调控185

第一节　细胞信号的种类185

一、物理信号185

二、化学信号186

第二节　信号转导受体的分类188

三、生物信号188

一、离子通道型受体189

二、G蛋白偶联受体189

三、具有酶活性的催化性受体190

四、细胞内受体191

第三节　细胞内信号分子191

一、偶联蛋白191

二、G蛋白192

三、第二信使193

四、非受体酪氨酸蛋白激酶193

五、丝裂原活化蛋白激酶194

六、蛋白激酶194

八、磷酸酶195

七、磷脂酶195

第四节　胞内与胞间信息研究196

一、细胞间信息传递及调控196

二、细胞内信息传递系统199

三、细胞核内信息传递及调控202

第十二章　大分子的制备和导入细胞204

第一节　小鼠卵细胞和胚胎的显微注射204

第二节　外源基因在哺乳动物细胞中转导和表达210

一、待转染细胞的准备211

二、质粒DNA的纯化212

三、外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法213

四、转染细胞的筛选223

一、免疫荧光抗体法检测表达蛋白质229

第三节　基因表达产物的检测229

二、免疫沉淀法检测表达蛋白质230

三、Western杂交分析检测表达蛋白质233

第十三章　代谢标记和蛋白质修饰238

第一节　32P磷酸稳态标记法238

第二节　mRNA体外细胞核连缀转录分析240

第三节　用透化细胞及透化细胞器研究蛋白质的磷酸化245

第四节　蛋白质的甲基化和异戊烯化作用250

第五节　蛋白质的糖基化252

第十四章　蛋白质表达和相互间作用256

第一节　T7表达系统的蛋白质产生及检测256

第二节　用GST基因融合载体表达和纯化蛋白质259

一、概述260

第三节　哺乳动物细胞表达系统260

二、脂质体介导的DNA瞬时转染261

三、DEAE-葡聚糖介导的瞬时转染262

第五篇　细胞培养的应用研究265

第十五章　细胞培养在功能与分化研究中的应用265

第一节　基本概念265

一、细胞分化265

二、细胞分化的机制266

第二节　培养细胞诱导功能表达与分化的实验266

一、体外定向诱导胚胎干细胞分化为造血细胞267

二、小鼠骨髓与脾来源树突细胞的分离与培养268

三、小鼠3T3细胞向脂肪细胞的分化270

四、体外诱导肝癌细胞株产生酪氨酸转氨酶272

五、U937细胞的分化274

六、恶性畸胎瘤细胞的分化276

七、小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导277

八、神经母细胞瘤LA-N-5细胞的分化诱导278

九、EB病毒壳抗原和早期抗原在体外细胞表达的检测279

第十六章　细胞培养在病毒学研究中的应用282

第一节　概述282

一、检测病毒282

二、病毒性感染的血清学诊断283

三、肿瘤病毒致癌机制的研究283

第二节　病毒的分离与鉴定284

一、用于病毒分离的细胞种类284

四、制备病毒疫苗284

二、病毒接种法及结果观察285

三、TCID50病毒感染性测定法286

四、病毒定量法（蚀斑形成试验）288

第三节　中和试验测定抗病毒抗体（微量法）289

一、原理289

二、蚀斑减少法289

三、细胞病变法测中和抗体290

第四节　体外抗病毒药效实验291

第五节　在病毒受体及致病机制研究方面的应用292

一、概述292

二、受体蛋白免疫血清的细胞保护性实验293

一、人工诱发细胞恶性转化295

第十七章　细胞培养在肿瘤学研究中的应用295

第一节　体外培养细胞的恶性转化295

二、试管内诱发癌实验法297

第二节　肿瘤细胞浸润与转移的检测299

一、原理299

二、肿瘤细胞电泳速度测定299

三、快速体外浸润实验300

四、球体器官培养侵袭实验301

第三节　肿瘤细胞端粒酶活性检测302

第四节　肿瘤细胞癌基因及抑癌基因检测304

一、聚合酶链反应-单链构象多态性分析法305

二、聚合酶链反应结合寡核苷酸探针杂交法308

第五节　肿瘤细胞体外药物敏感性检测309

一、四噻唑蓝法药物敏感试验310

二、致死细胞染色法药敏试验311

三、3H-TdR掺入法药物敏感试验312

第六节　肿瘤多药耐药基因及其表达产物的检测313

一、研究肿瘤多药耐药基因及其表达产物的意义313

二、常见肿瘤多药耐药基因mdr1及其表达产物P-gp的检测方法314

第十八章　细胞培养用于免疫学实验319

第一节　杂交瘤克隆及单克隆抗体制备319

一、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理319

二、骨髓瘤细胞的选择319

三、小鼠-小鼠B细胞杂交瘤技术320

一、树突细胞的体外制备与功能测定323

第二节　免疫细胞的体外制备与功能测定323

二、人自然杀伤细胞克隆的制备与活性测定325

三、T细胞克隆的制备与功能测定327

四、人巨噬细胞的获取与功能测定329

第三节　淋巴细胞体外增殖反应实验332

一、丝裂原刺激的淋巴细胞增殖反应332

二、混合淋巴细胞培养333

第四节　免疫效应细胞毒实验334

一、形态学检查法335

二、125I-UdR掺入法336

三、乳酸脱氢酶释放法337

四、四噻唑蓝法检测细胞毒活性337

一、IL-1活性测定338

第五节　细胞因子的检测338

二、IL-2活性测定339

三、IL-3活性测定343

四、IL-4活性测定343

五、IL-6活性测定344

六、IL-11活性测定344

七、IL-12活性测定345

八、IL-13活性测定346

九、IFN活性测定346

十、TNF的检测方法348

十一、GM-CSF活性测定351

一、细胞免疫网络概述352

二、T细胞网络352

第六节　细胞免疫网络调节研究352

三、B细胞网络353

四、杀伤细胞网络353

五、细胞因子网络353

六、T细胞、B细胞检测方法354

第七节　HLA检测355

一、HLA抗体筛选技术355

二、HLA抗原单克隆抗体分型技术359

第十九章　细胞培养在药理学研究中的应用363

第一节　测定药物对培养细胞生长影响的实验363

一、绘制生长曲线的细胞培养实验363

三、有丝分裂指数测定的细胞培养实验364

二、成集落的细胞培养实验364

四、缩时电影显微摄像术的细胞培养实验365

第二节　培养细胞或器官的放射自显影术和同位素液闪测定实验366

一、培养细胞的放射自显影术实验366

二、原位缺口平移的细胞或组织培养实验368

三、放射性同位素液闪测定的细胞培养实验369

第三节　培养细胞动作电位记录实验371

一、培养的神经细胞动作电位记录实验371

二、培养的心肌细胞收缩活动和动作电位记录实验372

第四节　培养细胞的膜片钳技术检测实验373

一、简介373

二、心肌细胞的膜片钳全细胞记录实验376

三、心肌细胞的穿孔膜片钳全细胞记录实验379

四、脑薄片膜片钳记录实验381

第五节　药物对培养神经细胞影响的检测实验383

一、培养神经细胞蛋白质总量的流式分析实验383

二、培养神经细胞的电特性测定实验384

三、培养神经细胞的免疫组化研究实验386

四、大鼠胎鼠皮质神经细胞原代培养实验387

第六节　检测神经生长因子与营养因子生物活性的体外实验388

一、交感神经节和脊神经节培养检测实验388

二、PC 12细胞培养检测实验389

三、神经营养因子基因表达的细胞培养研究390

第七节　心肌细胞培养在药理学研究中的应用391

一、乳鼠原代心肌细胞培养法392

二、乳鼠心肌细胞的实际应用394

三、成年大鼠心肌细胞培养方法396

第八节　检测培养的内皮细胞分泌的某些活性物质的实验398

一、药物对培养的血管内皮细胞血管内皮舒张因子／一氧化氮合酶活性影响的实验398

二、纤溶酶原激活物测定实验399

三、纤溶酶原激活物抑制剂活性测定实验402

四、血栓调节蛋白活性测定实验403

五、血管性血友病因子测定实验404

六、药物对培养的白细胞与内皮细胞黏附影响的实验405

七、细胞培养用于血管内皮细胞表面黏附分子P选择素的测定407

八、内皮细胞-单核细胞黏附率的测定实验408

第九节　细胞培养用于抗动脉粥样硬化药物研究的实验409

一、血管内皮细胞保护药实验409

二、血管平滑肌细胞增殖抑制药实验412

三、建立泡沫细胞模型的实验414

第十节　细胞培养用于影响血糖药物研究的实验416

一、脂肪细胞对葡萄糖的转运实验416

二、脂肪组织及脂肪细胞对葡萄糖的转化实验417

三、胰岛素对离体犊牛小肠上皮细胞增殖及吸收功能影响的实验418

第十一节　细胞培养用于影响生殖功能药物的实验研究419

一、黄体细胞培养实验419

二、精子穿卵实验420

三、促黄体生成素对睾丸功能影响的间质细胞培养实验421

第二十章　细胞毒性及遗传毒性检测423

第一节　细胞毒性检测423

一、细胞计数法423

二、台盼蓝拒染试验424

三、四噻唑蓝试验425

四、中性红试验426

五、结晶紫试验426

六、乳酸脱氢酶漏出率427

七、细胞中蛋白质含量测定429

八、细胞内还原型谷胱甘肽含量测定430

九、脂质过氧化产物生成量测定431

十、细胞DNA合成测定（3H掺入法）431

十一、细胞形态观察法432

第二节　遗传毒性检测433

一、哺乳类细胞基因突变实验433

二、人外周血淋巴细胞染色体畸变分析436

三、人体外周血淋巴细胞微核形成实验438

四、姊妹染色单体交换实验439

五、非程序性DNA合成实验441

六、DNA链断裂检测（彗星实验）443

七、DNA加合物检测445

八、DNA链间交联检测447

第二十一章　功能性细胞的制备449

第一节　胎肝细胞的制备与应用449

第二节　免疫活性淋巴细胞的制备与应用452

一、外周血单个核细胞的分离及淋巴细胞纯化452

二、淋巴细胞组分分离455

三、T细胞亚群分离458

四、自然杀伤细胞的分离461

五、LAK细胞/TIL的制备和活性测定462

第三节　胰岛细胞的制备与应用464

第四节　甲状腺细胞的制备与应用465

第五节　神经细胞的制备与应用467

一、神经元分离培养467

二、神经胶质细胞的培养468

第六节　造血干细胞的制备与应用472

附录479

附录一　实验室常用的细胞系（株）479

附录二　常用人工合成细胞培养液480

附录三　细胞培养及相关实验常用缓冲液481

附录四　离心速度和离心力换算表483

索引484