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1 基因工程的分子生物学基础1

1．1 遗传信息的传递和分子生物学的中心法则1

1．2 DNA分子的复制3

1．2．1 DNA分子复制的一般特点3

1．2．2 DNA聚合酶6

1．2．3原核和真核复制子和复制的调控8

1．3 原核和真核生物基因结构的特征15

1．4 RNA的转录和RNA的加工16

1．4．1RNA合成的基本特征16

1．4．2 RNA聚合酶17

1．4．3 与转录调控有关的DNA序列18

1．4．4 RNA的转录20

1．4．5 RNA转录后加工24

1．5 逆转录和逆转录酶32

1．6 翻译——蛋白质的生物合成34

1．6．1 遗传密码34

1．6．2参与蛋白质生物合成的生物大分子及其功能37

1．6．3 蛋白质生物合成的过程42

1．6．4蛋白质翻译后的修饰和加工47

1．6．5蛋白质的折叠48

1．6．6分子伴侣和折叠酶49

1．6．7细胞内蛋白质折叠的路径54

1．6．8蛋白质的剪接58

1．7基因表达的调控62

1．7．1 原核基因表达的调控63

1．7．2真核基因表达的调控67

参考文献82

2 基因工程的四大要素及实施要点85

2．1基因工程操作中常用的工具酶85

2．1．1限制性内切酶和甲基化酶85

2．1．2连接酶87

2．1．3用于基因工程中的修饰酶88

2．2 基因的分离90

2．2．1基因分离的物理化学方法90

2．2．2鸟枪法分离基因90

2．2．3cDNA文库的建立与基因的分离90

2．2．4 直接从特定的mRNA分离基因94

2．2．5 基因组文库的建立和基因的分离94

2．2．6 从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因94

2．2．7基因的化学合成95

2．2．8利用PCR或RT-PCR分离基因97

2．3基因工程载体97

2．3．1质粒载体98

2．3．2λ噬菌体载体103

2．3．3 粘质粒载体106

2．3．4 M13噬菌体载体及噬菌粒107

2．3．5 真核细胞用载体110

2．3．6人工染色体112

2．4受体细胞和重组基因的导入114

2．5 基因重组的方法116

2．6 基因重组体的筛选120

参考文献124

3外源基因在宿主细胞中的高效表达125

3．1有效的转录起始与基因的高效表达125

3．2 mRNA的有效延伸和转录终止与基因的高效表达126

3．3 mRNA的稳定性与基因的高效表达127

3．4有效的翻译起始与基因的高效表达127

3．5 遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达128

3．6 mRNA的二级结构与基因的高效表达131

3．7RNA的加工与基因的高效表达131

3．8 mRNA序列上终止密码的选择131

3．9表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性与基因的高效表达132

3．10外源蛋白的稳定性与基因的高效表达132

参考文献133

4 基因的融合和融合蛋白的表达134

4．1利用基因融合技术表达外源基因的缘由134

4．2基因融合的策略134

4．3基因融合和重组蛋白的产生136

4．4基因融合和显示筛选137

4．5 基因融合和蛋白分泌137

4．6融合蛋白的纯化138

4．7融合蛋白的位点特异性切割138

参考文献139

5 外源蛋白的分泌表达141

5．1外源基因在E.coli中的分泌表达141

5．2外源基因在枯草杆菌中的分泌表达143

5．3α-因子前导序列介导的酵母细胞分泌系统144

参考文献146

6 重组蛋白的正确折叠及修饰147

6．1重组蛋白的可溶性表达和折叠147

6．2 重组蛋白的重折叠149

6．3外源蛋白在翻译后的修饰151

参考文献151

7几种真核细胞表达系统153

7．1COS细胞瞬时表达系统及其应用153

7．2哺乳动物细胞稳定表达系统157

7．3外源基因在哺乳动物细胞中的组成性表达和诱导性表达160

7．4核型多角体病毒为载体的昆虫（细胞）表达系统161

7．4．1构建核型多角病毒载体的原理162

7．4．2转移载体质粒的构建163

7．4．3重组病毒的组建和筛选165

7．4．4产生重组病毒的新策略166

7．4．5对NPV/昆虫（细胞）表达系统的评估169

7．5 关于转基因动物170

参考文献171

8 分子杂交技术173

8．1探针与目标核酸相互作用的原理173

8．2 探针的选择和特异性175

8．3 杂交的速率与探针长度、浓度及杂交加速剂的关系176

8．3．1杂交的速率与探针长度及复杂性176

8．3．2杂交速率与探针的浓度176

8．3．3杂交的加速剂和杂交速率177

8．4 杂交的最适条件178

8．5 放射性探针的制备179

8．5．1双链DNA探针的制备179

8．5．2单链DNA探针的制备181

8．5．3单链RNA探针的制备181

8．5．4产生杂交探针的其他方法183

8．5．5选择放射性同位素的原则183

8．5．6标记探针的比放射活度测定184

8．5．7放射性标记探针的纯化185

8．6非放射性探针的制备185

8．7 放射性和非放射性标记探针的应用范围188

参考文献189

9 粒子轰击和基因转移191

参考文献193

10 聚合酶链反应及其应用194

10．1 聚合酶链反应的原理194

10．2标准的PCR扩增方案194

10．3对PCR反应中几种主要组成的分析195

10．4与PCR相关的技术及PCR技术的应用201

参考文献207

11 噬菌体显示技术208

11．1两类表达载体208

11．2噬菌体显示技术的操作209

11．3 噬菌体显示技术的应用210

参考文献212

12 基因打靶技术及其应用213

12．1 同源重组与基因打靶213

12．2基因打靶载体213

12．3影响基因打靶效率的因素215

12．4转染DNA的方法及重组体的检定215

12．5基因打靶技术的应用218

参考文献219

13DNA序列分析220

13．1 Sanger的双脱氧链终止测序法220

13．2Maxam-Gilbert DNA 化学降解法223

13．3 关于变性聚丙烯酰胺测序凝胶224

参考文献224

14 基因突变225

14．1 寡核苷酸介导的基因突变225

14．1．1寡核苷酸介导的基因突变的操作步骤225

14．1．2寡核苷酸介导的基因突变中应注意的各种因素225

14．1．3 几种寡核苷酸介导的基因突变的方法229

14．2盒式突变法235

14．3利用PCR进行DNA序列的突变236

14．4关于随机突变240

14．4．1利用化学试剂进行的随机突变241

14．4．2酶法随机错误掺入突变法241

14．4．3其他产生随机突变的方法243

参考文献243

15寡核苷酸的化学合成245

15．1寡核苷酸片段固相合成的原理及步骤245

15．1．1用于寡核苷酸化学合成的单体245

15．1．2用于寡核苷酸化学合成的固相载体246

15．1．3 寡核苷酸片段合成的步骤246

15．2寡核苷酸片段的纯化及检定250

15．2．1寡核苷酸片段从固相载体上切离和去保护基250

15．2．2 寡核苷酸片段的脱盐250

15．2．3寡核苷酸片段合成产率的估计250

15．2．4寡核苷酸片段的纯化251

15．2．5DNA寡核苷酸片段的检定252

16 几种有开发前景的研究253

16．1转录因子的研究与治疗药物的开发253

16．2真核细胞受体的克隆和表达为药物开发提供了新思路253

16．3反义核酸技术254

16．4DAN疫苗254

参考文献255

17 蛋白质工程概述256

参考文献259