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1　光学显微镜基础1

1.1 简介1

1.2　复式显微镜的关键部件2

1.2.1　镜体和镜灯2

1.2.2　聚光镜3

1.2.3　载物台和聚焦机制3

1.2.4　物镜3

1.2.5 目镜4

1.3　显微镜使用技术4

1.3.1　明视野显微镜术4

实验方案1.1　明视野显微镜的调节4

实验方案1.2　调定柯勒照明5

1.3.2　油镜的使用5

实验方案1.3　调焦步骤5

1.3.3　相差显微镜术6

实验方案1.4　相差显微镜的调节6

1.3.4　微分干涉对比显微镜术7

1.3.5　暗视野显微镜术7

1.3.6　荧光显微镜术7

实验方案1.5　调定落射荧光显微镜8

1.3.7　共聚焦显微镜术8

1.3.8　常见问题及显微镜保养和维修9

1.4　样本的准备和染色10

1.4.1 附着10

实验方案1.6　多聚L-赖氨酸包被10

1.4.2 固定10

1.4.3　准备组织切片11

1.4.4　染色11

参考文献11

2　电子显微镜基础12

2.1　简介12

2.2　可用的电子显微镜方法12

2.2.1　负染色法12

2.2.2　玻璃化技术13

2.2.3　金属投影和冰冻断裂技术13

2.2.4　免疫标记13

2.2.5　专门技术13

2.2.6　设备与试剂的危险性14

实验方案2.1 聚乙烯醇缩甲醛-碳、连续碳和多孔碳支持膜的制备14

实验方案2.2　“微滴”负染色步骤（使用连续碳、聚乙烯醇缩甲醛-碳及多孔碳支持膜）15

实验方案2.3　免疫负染法16

实验方案2.4　负染色-碳膜技术：细胞及细胞器的分裂17

实验方案2.5　未染色及负染色的玻璃化样本制备18

实验方案2.6　生物样品的金属投影技术19

实验方案2.7　组织加工及树脂包埋的常规实验方案20

实验方案2.8　对细胞及细胞器悬液的琼脂糖胶囊化21

实验方案2.9 电镜超薄切片的常规染色22

实验方案2.10　包埋后薄切片的间接免疫标记23

实验方案2.11 使用免包埋电子显微镜技术显示核基质和细胞骨架24

致射28

参考文献29

3　细胞培养30

3.1　细胞：分离和分析30

3.2　机械法分离组织31

实验方案3.1　机械剪切作用使组织解聚31

实验方案3.2　使用温热的胰蛋白酶使组织解聚32

实验方案3.3　冷胰蛋白酶消化34

实验方案3.4　应用胶原酶或中性蛋白酶解聚35

3.3　从体液中分离细胞36

实验方案3.5　从渗出液中回收细胞36

3.4　去除红细胞37

实验方案3.6　急速裂解法去除红细胞37

实验方案3.7　等密度离心法去除红细胞和死细胞38

3.5　细胞计数和细胞活力38

实验方案3.8　细胞计数和活力测定39

3.6　细胞培养的用途41

实验方案3.9　从单层培养物回收细胞41

3.7　冷藏42

实验方案3.10　冻存细胞43

实验方案3.11　解冻细胞44

3.8　外周血单核细胞的分离45

3.8.1　应用密度阻滞45

3.8.2　应用混合技术45

3.8.3　应用阻滞漂浮技术46

实验方案3.12　密度阻滞法纯化人外周血单核细胞47

实验方案3.13　混合剂技术纯化人外周血单核细胞47

实验方案3.14　阻滞浮选技术纯化人外周血单核细胞48

参考文献49

4　细胞器的分离与功能分析51

4.1 简介51

4.2　匀浆化51

4.3　差速离心52

4.3.1 器材53

4.4　密度梯度离心53

4.5　细胞核及核组分54

4.5.1　细胞核54

4.5.2　核组分54

4.6　线粒体55

4.6.1　酶标记物55

4.7　溶酶体55

4.7.1　酶标记物55

4.8　过氧化物酶体56

4.8.1　酶标记物56

4.9　粗面与光面内质网56

4.9.1　酶和化学标记物56

4.10　高尔基膜57

4.10.1　酶标记物57

4.11　质膜57

4.11.1　用酶标记物分析质膜57

4.12　叶绿体58

4.12.1　叶绿体功能分析58

实验方案4.1 用碘克沙醇梯度溶液从哺乳动物肝脏中分离细胞核（并注意培养细胞）58

实验方案4.2　中期染色体的分离59

实验方案4.3　核膜的分离60

实验方案4.4　核孔复合物的分离61

实验方案4.5　核基质的制备62

实验方案4.6　核仁的制备63

实验方案4.7　用差速离心法从大鼠肝脏中分离重线粒体组分64

实验方案4.8　从组织和培养细胞中制备轻线粒体组分65

实验方案4.9　用Nycodenz？不连续梯度溶液纯化酵母线粒体66

实验方案4.10　用中等载量Nycodenz？不连续梯度溶液从哺乳动物肝脏或培养细胞中纯化线粒体67

实验方案4.11　琥珀酸-碘代硝基四唑盐紫还原酶检测68

实验方案4.12　不连续Nycodenz？梯度溶液中溶酶体的分离68

实验方案4.13　β-半乳糖苷酶（分光光度测定）69

实验方案4.14　β-半乳糖苷酶（荧光测定）70

实验方案4.15　碘克沙醇梯度提取哺乳动物的过氧化物酶体70

实验方案4.16　过氧化氢酶检测71

实验方案4.17　碘克沙醇梯度溶液分析主要细胞器72

实验方案4.18　蔗糖梯度溶液分离光面及粗面内质网74

实验方案4.19 以自生成碘克沙醇梯度溶液分离光面与粗面内质网75

实验方案4.20　NADPH-细胞色素c还原酶检测76

实验方案4.21　葡萄糖-6磷酸酶检测77

实验方案4.22　RNA分析78

实验方案4.23　从肝脏分离高尔基膜78

实验方案4.24　UDP半乳糖半乳糖基转移酶的检测79

实验方案4.25　人血影细胞的纯化80

实验方案4.26　大鼠肝脏中细胞膜的分离81

实验方案4.27　5′-核苷酸酶测定82

实验方案4.28　碱性磷酸二酯酶测定82

实验方案4.29 哇巴因敏感的Na+/K+-ATP酶测定83

实验方案4.30　绿叶或豌豆幼苗中叶绿体的分离84

实验方案4.31 叶绿体中叶绿素含量的测定85

实验方案4.32　叶绿体完整性的测定85

参考文献86

5　在跨膜运输和细胞信号转导研究中使用的亚细胞膜的分级分离方法89

5.1 简介89

5.2　可采用的研究方法89

5.3　质膜区域90

5.4　参与内质网-高尔基体-质膜路径的膜区室的分析90

5.4.1　蔗糖-D20梯度90

5.4.2　浮力密度碘克沙醇梯度（预形成）91

5.4.3　沉降速度碘克沙醇梯度（预形成）91

5.4.4　用SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析91

5.5　从胞浆蛋白中分离膜囊泡92

5.6 内吞作用92

5.6.1 配体标记92

5.6.2　组织系统92

5.6.3　细胞系统92

5.6.4　分析93

实验方案5.1 利用蔗糖梯度从哺乳动物肝脏分离基底外侧和胆汁小管的质膜区域93

实验方案5.2　用抗体结合珠分离大鼠肝脏窦状区域94

实验方案5.3　用蔗糖梯度溶液从Caco-2分离顶端和基底外侧区域94

实验方案5.4　碘克沙醇梯度离心法从MDCK细胞中分离顶端和基底外侧区域95

实验方案5.5　脂筏的分离97

实验方案5.6　细胞膜小凹的分离99

实验方案5.7　利用不连续蔗糖-D2O密度梯度分析细胞的高尔基体和内质网亚结构100

实验方案5.8　利用连续碘克沙醇密度梯度法分析细胞的高尔基体、内质网、内质网-高尔基体中间复合物和其他膜结构101

实验方案5.9　利用连续或非连续沉淀速率碘克沙醇密度梯度分析细胞的高尔基体、内质网、反式高尔基网络和其他膜结构103

实验方案5.10　细胞膜蛋白的SDS-PAGE105

实验方案5.11　半干印迹106

实验方案5.12　用增强化学发光法检测印迹蛋白106

实验方案5.13　从哺乳动物细胞和细菌中分离胞膜以及胞质组分107

实验方案5.14　分析在碘克沙醇组分中的早期和再循环的内吞体、转染的MDCK细胞中对转铁蛋白的内吞作用109

实验方案5.15　利用自生成的碘克沙醇梯度分析笼形蛋白包被囊泡的加工、大鼠肝脏无唾液酸糖蛋白的内吞作用111

实验方案5.16　多聚蔗糖-Nycodenz？梯度用于分析哺乳动物肝脏中致密内体-溶酶体活动112

参考文献113

6　体外实验技术117

6.1 简介117

实验方案6.1　使用人类无细胞系统的偶联DNA修复合成的核小体装配117

实验方案6.2～实验方案6.4——简介121

实验方案6.2　用卤代脱氧胸腺嘧啶核苷类似物单标新生DNA121

实验方案6.3　用不同卤代脱氧胸腺嘧啶核苷类似物双标DNA123

实验方案6.4 同时对蛋白质和取代卤素-dU的DNA进行免疫染色125

实验方案6.5　暴露培养细胞内的核基质127

实验方案6.6～实验方案6.7　核基质与核纤层的相互作用——简介131

实验方案6.6　核基质-核纤层蛋白相互作用：体外印迹覆盖分析132

实验方案6.7　核基质-核纤层蛋白相互作用：体外核重组装分析133

实验方案6.8　非洲爪蛙卵提取物的制备和免疫耗竭136

实验方案6.9　体外核组装和免疫荧光138

实验方案6.10　应用离体非洲爪蛙卵母细胞核检测核质之间的转运140

实验方案6.11　在核膜片的微阵列中用光学单转运体记录的方法检测转运143

6.2　细胞和膜系统146

实验方案6.12　链球菌溶血素0导致的细胞透化作用146

实验方案6.13　纳米胶囊：细胞内传送药物的新型载体147

实验方案6.14　酵母中抗氧化蛋白保护作用的检测方法的快速筛选150

实验方案6.15　神经细胞凋亡的体外检测153

实验方案6.16～实验方案6.20　线粒体膜通透性的转变——简介156

实验方案6.16　线粒体膜通透性转变的测定：共聚焦激光成像法检测细胞或分离的线粒体中通透性转变与△φm的降低157

实验方案6.17 线粒体膜通透性转变的测定：用罗丹明123通过荧光计来检测通透性转变与△φm的降低158

实验方案6.18　线粒体膜通透性转变的测定：用流式细胞仪检测细胞及分离的线粒体中通透性转变与△φm的降低159

实验方案6.19　用蛋白印迹检测分离的线粒体中细胞色素c的释放160

实验方案6.20　将蛋白质输入分离的线粒体160

实验方案6.21　体外三元可溶性NSF附着蛋白受体复合物的生成161

实验方案6.22　肝脏内质网的体外重构163

实验方案6.23　糖脂不对称地掺入膜以及脂质跨膜运动的检测165

实验方案6.24　从大鼠脑组织纯化网格蛋白包被的囊泡170

实验方案6.25　在脂单层上重构内吞中间体171

实验方案6.26　高尔基膜管的形成173

实验方案6.27　紧密连接组合体175

实验方案6.28　重构主要捕光叶绿素a-捕光叶绿素b复合体到脂质体178

实验方案6.29 重构光系统2到脂质体182

实验方案6.30　体内及体外的高尔基体-波形蛋白相互作用183

6.3　细胞骨架和纤维系统188

实验方案6.31　微管过氧化物酶体相互作用188

实验方案6.32　免疫金免包埋电子显微镜法测定细胞基质蛋白191

实验方案6.33　紫杉醇和其他微管组装启动子诱导的微管组装197

实验方案6.34　波形蛋白的产生、纯化和组装及利用电子顺磁共振的研究201

实验方案6.35　神经丝装配205

实验方案6.36　微管蛋白诱导α-突触核蛋白形成209

实验方案6.37　体外合成β-淀粉样纤维211

实验方案6.38　体外可溶性Aβ1-42肽诱导的τ样过磷酸化212

实验方案6.39　反义肽216

实验方案6.40　β-淀粉样蛋白和酶的相互作用221

实验方案6.41　Aβ的磷酸化225

实验方案6.42　体外Smitin-肌球蛋白Ⅱ装配测定228

实验方案6.43　在EF-手型钙结合蛋白S100A4存在条件下，体外组装／拆卸肌球蛋白丝230

实验方案6.44　体外组装胶原纤维232

7　细胞和分子生物学参考数据235

7.1　化学品安全信息235

7.2　离心资料238

7.2.1　离心力的计算238

7.2.2　转子的应用239

7.2.3　沉淀时间的计算239

7.2.4　离心设备的保养239

7.3　放射性同位素数据240

7.3.1　核酸酶抑制剂240

索引242