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第一篇 植物基因工程的目的基因1

第一章 抗植物病虫害基因及其应用1

1.1抗植物虫害基因及其应用2

1.1.1Bt基因及其应用2

1.1.2蛋白酶抑制剂基因及其应用6

1.1.3植物疑集素基因及其应用8

1.1.4淀粉酶抑制剂基因及其应用10

1.2抗植物病毒基因及其应用10

1.2.1CP基因及其应用10

1.2.2病毒复制酶基因及其应用12

1.2.3病毒卫星RNA的利用12

1.2.4核糖体失活蛋白基因及其应用13

1.2.6缺陷干扰颗粒的利用14

1.2.5干扰素基因及其应用14

1.3抗植物真菌病害基因及其应用15

1.3.1几丁质酶基因与β-1,3-葡聚糖酶基因及其应用16

1.3.2植物抗毒素基因及其应用17

1.3.3RIP基因及其应用18

1.3.4过氧化物酶基因及其应用18

1.4抗植物细菌病害基因及其应用18

1.4.1病原菌本身的抗性基因及其应用18

1.4.2杀菌肽基因及其应用19

1.4.3溶菌酶基因及其应用20

第二章 抗非生物胁迫、改良作物产品质量的基因及应用21

2.1抗非生物胁迫基因及其应用21

2.1.1耐除草剂基因及其应用21

2.1.2抗其它非生物胁迫基因及其应用26

2.2.1控制果实成熟期的基因及其应用29

2.2改良作物品种质量的基因及其应用29

2.2.2谷物种子贮藏蛋白基因及其应用32

2.2.3改良脂肪酸组成的基因工程34

2.3提高作物产量的基因及其应用35

2.3.1植物光合作用机理及提高作物产量的设想35

2.3.2提高作物产量的基因及其应用36

第三章 改变植物其它性状的基因及植物医药基因工程39

3.1植物甜味蛋白基因及其应用39

3.2植物激素基因工程39

3.2.1iaaM和iaaH基因及其应用40

3.2.2ipt基因及其应用41

3.3改变植物花色的基因及其应用41

3.4植物雄性不育基因及其应用42

3.4.1植物雄性不育的遗传基础42

3.4.2植物雄性不育基因的应用44

3.5植物医药基因工程45

3.5.1植物医药基因工程的含义及意义45

3.5.2在植物中表达抗体46

3.5.3在植物中表达动物疫苗50

第四章 基因克隆所需的工具酶和载体53

4.1基因克隆所需的工具酶53

4.1.1限制性内切酶53

4.1.2DNA和RNA连接酶58

4.1.3DNA聚合酶59

4.1.4基因工程中所用的其它酶类63

4.2基因克隆所需的载体63

4.2.1质粒载体64

4.2.2λ噬菌体载体71

4.2.3粘粒载体76

4.2.4单链噬菌体载体77

第五章 目的基因的制备与克隆82

5.1化学法合成目的基因82

5.1.1磷酸二酯法82

5.1.2亚磷酸三酯法83

5.1.3寡核苷酸连接法84

5.2基因文库的构建85

5.2.1外源DNA大片段的制备86

5.2.2用于基因文库构建的载体及其制备86

5.2.3载体与外源DNA片段的连接87

5.2.4体外包装及基因组DNA文库的扩增87

5.3cDNA的合成和克隆88

5.3.1mRNA的提取及其完整性的确定88

5.3.2cDNA的合成与克隆90

5.3.3目的cDNA克隆的鉴定96

5.4多聚酶链式反应在目的基因制备中的作用98

5.4.1多聚酶链式反应的原理98

5.4.2PCR技术在目的基因制备中的应用99

5.4.3PCR技术在分子克隆中的其它应用100

第六章 重组体的构建及向宿主细胞的导入104

6.1载体DNA的提取及纯化104

6.1.1宿主细胞的培养和收获104

6.1.2细胞的裂解104

6.1.3质粒DNA的分离与纯化105

6.2外源DNA片段与载体分子的连接-重组体的构建106

6.2.1DNA连接酶的作用机理106

6.2.2影响连接反应的因素106

6.3重组体向受体细胞的导入109

6.3.1转化110

6.3.2转导和转染112

6.3.3对宿主菌的要求112

第七章 重组体的筛选与鉴定114

7.1重组体的筛选114

7.1.1遗传学方法114

7.1.2核酸杂交法115

7.1.3免疫学筛选法119

7.1.4转译筛选法121

7.1.5快速少量制备质粒DNA进行限制酶切分析121

7.1.6重组探针法122

7.2重组体的鉴定和分析122

7.2.1限制酶切图谱122

7.2.3插入失活定位123

7.2.2亚克隆123

7.2.4电子显微镜作图124

7.2.5转录产物作图125

7.2.6基因产物分析125

7.2.7DNA序列分析126

第八章 植物基因工程载体及其构建134

8.1植物基因工程载体种类及命名规则134

8.1.1植物基因工程载体的命名规则134

8.1.2植物基因工程载体的种类及特性134

8.2根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能135

8.2.1Ti质粒的遗传特性、结构及功能135

8.2.2T-DNA的基因结构与功能140

8.2.3Vir区操纵子的基因结构与功能143

8.3.1T-DNA的加工及转移146

8.3农杆菌Ti质粒基因转化机理146

8.3.2T链蛋白复合体的形成及VirE的功能148

8.3.3T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能148

8.3.4T链复合体靶向植物细胞核150

8.3.5T链整合植物基因组的分子机理151

8.3.6农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控153

8.4农杆菌Ti质粒的改造及载体构建154

8.4.1Ti质粒的改造及卸甲载体构建154

8.4.2中间载体的构建156

8.4.3中间表达载体的构建158

8.4.4植物基因转化载体系统的构建160

8.5载体构建中常用的选择标记及报告基因167

8.5.1选择标记的应用及原理168

8.5.2报告基因的应用及原理173

8.5.3选择标记和报告基因的选择策略174

8.6常用的植物基因工程载体175

8.6.1常用的植物基因工程中间表达载体175

8.6.2植物基因工程常用的Cis载体（一元载体）177

8.6.3植物基因工程常用的双元载体178

第二篇 目的基因的转化179

第九章 植物基因转化受体系统的建立179

9.1植物基因转化受体系统的条件179

9.2植物基因转化受体系统的类型及其特性182

9.2.1愈伤组织再生系统182

9.2.2直接分化再生系统182

9.2.3原生质体再生系统183

9.2.4胚状体再生系统184

9.2.5生殖细胞受体系统184

9.3.1高频再生系统的建立185

9.3植物基因转化受体系统的建立程序185

9.3.2抗生素敏感性试验188

9.3.3农杆菌的敏感性试验及菌种的选择189

9.4植物基因转化受体系统建立中常遇的问题189

9.4.1试管苗的玻璃化现象189

9.4.2培养物的褐化190

9.4.3白化苗的产生192

9.4.4试管苗的移栽成活率193

第十章 根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化194

10.1根癌农杆菌的生物学特性195

10.1.1根癌农杆菌的形态结构、生活习性及寄主范围195

10.1.2根癌农杆菌的分类及鉴定195

10.1.4根癌农杆菌附着植物细胞的机理196

10.2根癌农杆菌侵染植物细胞的化学机理196

10.1.3根癌农杆菌的遗传寄主及内共生原理196

10.2.1根癌农杆菌的趋化性198

10.2.2根癌农杆菌侵染的诱导物及作用机理198

10.2.3冠瘿碱的化学特性及功能201

10.3根癌农杆菌的侵染能力及其特异性205

10.3.1基因转化中常用的根癌农杆菌菌系及菌株205

10.3.2根癌农杆菌的侵染能力的内在因素205

10.3.3根癌农杆菌的侵染能力差异及植物的敏感反应208

10.4根癌农杆菌的转化策略210

10.4.1Ti质粒载体系统的选择210

10.4.2利用野生型致瘤载体转化策略213

10.4.3利用非致瘤载体的转化策略216

10.5根癌农杆菌转化程序及操作原理217

10.5.2根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备218

10.5.1根癌农杆菌Ti质粒的转化基本程序218

10.5.3Vir区基因活化诱导物的使用220

10.5.4外植体的选择221

10.5.5外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养223

10.5.6外植体脱菌及选择培养226

10.6根癌农杆菌Ti质粒转化的方法228

10.6.1整体植株接种共感染法228

10.6.2叶盘转化法229

10.6.3原生质体共培养转化方法231

10.7根癌农杆菌转化系统的评述232

第十一章 发根农杆菌Ri质粒载体基因转化237

11.1发根农杆菌的生物学特性237

11.1.1发根农杆菌的宿主及转化体的特性237

11.1.2发根农杆菌的分类及命名238

11.1.3毛状根是单细胞克隆体240

11.1.4发根农杆菌的冠瘿碱合成240

11.2Ri质粒的基因结构与功能240

11.2.1Ri质粒的酶切图谱240

11.2.2Ri质粒基因结构及与Ti质粒的同源性241

11.2.3Vir区的基因结构与功能243

11.2.4Ri质粒T区的基因结构与功能243

11.3发根农杆菌基因转化策略246

11.3.1共整合载体转化246

11.3.2双元载体转化246

11.4发根农杆菌基因转化的方法及操作247

11.4.1转化方法247

11.5.1发根农杆菌的种类之间侵染能力的差异248

11.5Ri质粒基因转化的影响因素248

11.4.2毛状根的培养248

11.5.2Vir区基因的影响249

11.5.3发根农杆菌染色体基因的影响249

11.5.4宿主本身的作用是发根农杆菌侵染的重要因素249

11.6Ri质粒T-DNA在转化体中的遗传特性250

11.6.1转化体的遗传稳定性250

11.6.2T-DNA在受体细胞的整合特性250

11.7发根农杆菌转化的应用251

11.7.1促进生根251

11.7.2增强抗逆性251

11.7.3次生代谢产物生产251

11.7.4农杆菌与植物之间的进化关系251

12.1.1植物病毒的种类及其基因组254

12.1植物病毒的生物学特性254

第十二章 植物病毒载体介导基因转化254

12.1.2植物病毒的形态结构及化学组成256

12.1.3植物病毒的侵染机理257

12.1.4病毒的装配258

12.2双链DNA病毒转化载体259

12.2.1CaMV的形态结构及其特性259

12.2.2CaMV的分子结构260

12.2.3CaMV的基因及其功能262

12.2.4CaMV的转录体262

12.2.5CaMVDNA的复制263

12.2.6CaMV基因组的突变、删除、插入264

12.2.7CaMV作为植物基因工程载体的探索266

12.3.1双联体病毒的生物学特性267

12.3植物单链DNA病毒转化载体267

12.3.2GeNV的基因组结构268

12.4植物单链RNA病毒的基因转化载体271

12.4.1单链RNA病毒的特性271

12.4.2RNA病毒的复制和表达271

12.4.3RNA病毒作为基因转化载体的探索272

12.5反转录病毒基因转化载体273

12.5.1反转录病毒的分子生物学特点273

12.5.2反转录病毒载体构建的一般原理及方法275

12.5.3反转录病毒转化载体的类型275

12.5.4反转录病毒载体存在的问题276

12.6植物病毒作为基因转化载体的应用潜力和策略276

12.6.3病毒载体与质粒载体的比较及应用潜力277

12.6.2病毒载体系统的选择策略277

12.6.1病毒载体系统的基本条件277

第十三章 DNA直接导入基因转化及原理281

13.1化学诱导DNA直接转化281

13.1.1PEG介导基因转化281

13.1.2脂质体介导基因转化284

13.2物理法诱导DNA直接转化286

13.2.1电激法介导基因转化286

13.2.2超声波介导基因转化289

13.2.3显微注射介导基因转化291

13.2.4激光微束介导基因转化292

13.2.5基因枪法介导基因转化295

第十四章 种质系统介导基因转化304

14.1花粉管通道法介导基因转化304

14.1.1花粉管导入的原理305

14.1.2花粉管导入的分子验证及实验证据309

14.1.3花粉管通道法的操作程序311

14.1.4对花粉管通道法的技术评价312

14.2生殖细胞浸泡法介导基因转化313

14.2.1浸泡转化法的原理313

14.2.2浸泡转化法的程序315

14.2.3浸泡转化法的技术评价315

14.3胚囊、子房注射法介导基因转化315

14.3.1胚囊、子房注射法的原理316

14.3.2胚囊、子房注射法的操作程序316

14.3.3胚囊、子房注射法的初步证据317

15.1.2基因转化系统的评价条件319

15.1.1基因转化系统的概念319

15.1植物基因转化系统的分析319

第十五章 植物基因转化系统的选择策略及单子叶植物基因转化319

15.1.3植物基因转化系统总汇320

15.1.4各种转化系统的比较321

15.2植物基因转化系统的选择原则322

15.3单子叶植物的基因转化323

15.3.1农杆菌介导单子叶植物基因转化323

15.3.2DNA直接导入法对单子叶植物的基因转化329

15.3.3种质系统导入法对单子叶植物的基因转化332

15.3.4单子叶植物转化使用的选择标记及报告基因332

第三篇 外源基因的表达、检测及遗传特性335

第十六章 转化外源基因在植物细胞中的表达调控335

16.1高等植物基因表达调控机理335

16.1.1高等植物基因的分子结构特点336

16.1.3顺式作用元件的转录调控338

16.1.2高等植物基因表达调控系统的特点338

16.1.4反式作用因子的调控340

16.1.5高等植物基因表达的转录后调控342

16.2转化外源基因的瞬时表达和稳定表达342

16.2.1转化外源基因的瞬时表达342

16.2.2转化外源基因的稳定表达345

16.2.3转化外源基因的同源性和异源性表达345

16.3DNA序列对转化外源基因的表达调控347

16.3.1植物基因工程中常用的启动子及其对转录的调控作用347

16.3.2终止子的转录调控作用353

16.3.35′,3′端序列对外源基因转录后的调控作用353

16.3.4内含子对转化外源基因的表达调控作用356

16.3.5信号肽序列对转化外源基因翻译产物的调控作用357

16.4DNA甲基化对转化外源基因表达的调控作用358

16.4.1DNA甲基化的作用机制359

16.4.2DNA甲基化在转基因植物中的作用359

16.4.3后成修饰与转基因的失活359

16.5激素对转化外源基因表达的调控作用360

16.5.1细胞分裂素对转化外源基因的表达调控360

16.5.2生长素对转化外源基因的表达调控361

16.5.3GA对转化外源基因的表达调控362

16.5.4乙烯对转化外源基因的表达调控363

16.5.5脱落酸对转化外源基因的表达调控364

16.6提高转化外源基因表达的策略364

16.6.1克服转化外源基因失活的策略364

16.6.2增强子的正确利用365

16.6.3构建高效表达的转化载体365

16.6.4优化先导序列、提高翻译效率366

第十七章 外源基因整合的鉴定368

17.1分子杂交概述368

17.2Southern杂交369

17.2.1植物总DNA提取370

17.2.2杂交探针的制备376

17.2.3Southern斑点杂交398

17.2.4Southern印迹杂交398

17.2.5Southern原位杂交417

17.3PCR-Southern杂交检测418

17.3.1PCR技术概述418

17.3.2转基因植株PCR-Southern杂交检测423

17.4外源基因整合的RFLP及RAPD分析425

17.4.1RFLP分析原理425

17.4.2RAPD分析原理426

第十八章 外源基因表达的检测428

18.1报告基因的酶法检测428

18.1.1Gus基因的检测428

18.1.2Cat基因的检测432

18.1.3冠瘿碱合成酶基因的检测435

18.1.4荧光素酶基因的检测436

18.1.5Npt-Ⅱ基因的检测437

18.1.6Pat基因的检测439

18.1.7DHFR基因的检测439

18.2外源基因转录的检测440

18.2.1Northern杂交440

18.2.2RT-PCR检测447

18.3外源基因表达蛋白的检测448

18.3.1ELISA检测448

18.3.2Westhern杂交452

18.3.3表达蛋白的含量测定457

第十九章 转基因植物的遗传特性460

19.1转基因植物中外源DNA的整合位点和拷贝数460

19.1.1整合位点460

19.1.2整合拷贝数462

19.1.3转基因植物中整合基因的重排及结构变化462

19.2转基因植物中外源DNA整合的遗传效应463

19.2.1外源DNA整合的位置效应463

19.2.2同源基因的共抑制效应464

19.2.3外源基因的重排效应466

19.3转化外源基因的稳定性466

19.3.1外源基因在转化细胞培养中的稳定性466

19.3.2外源基因在遗传传递中的稳定性467

19.3.3转基因植株的倍性变化468

19.4外源基因在转化植株中的遗传传递规律468

19.4.1单位点插入外源基因的遗传传递规律469

19.4.2多位点插入外源基因的遗传传递规律470

19.5转化方法对整合外源基因结构及遗传特性的影响470

19.5.1转化方法对外源DNA结构的影响470

19.5.2转化方法对外源基因遗传稳定性的影响473

19.5.3不同转化方法的遗传特性比较474

第二十章 植物基因工程存在的问题及新策略477

20.1植物基因工程的研究进展477

20.2植物基因工程存在的技术问题477

20.2.1提高基因转化率477

20.3植物基因工程潜在的应用问题478

20.2.4提高转化外源基因的遗传稳定性478

20.2.2建立高频再生的基因转化受体系统478

20.2.3提高对转化外源基因表达的调控能力478

20.3.1植物基因工程与常规育种的关系479

20.3.2植物基因工程与农业资源遗传多样性保护479

20.3.3植物基因工程与病虫抗药性479

20.3.4植物基因工程与环境生态平衡480

20.4植物基因转化的新策略481

20.4.1反义RNA的基因操作481

20.4.2核酶基因操作484

20.4.3无毒信号基因介导广谱抗病新策略487

20.4.4转座子载体系统介导的基因转化策略490

20.5.1产物已知的基因克隆策略494

20.5.2产物未知的基因克隆策略494

20.5植物目的基因克隆新策略494

20.5.3核DNA减法克隆基因新策略498

20.5.4mRNA差异显示法基因克隆新策略501

20.6展望503

第四篇 植物基因工程实验技术506

第一部分 目的基因克隆及载体构建506

实验1-1大肠杆菌质粒DNA提取506

实验1-2大肠杆菌质粒DNA纯化509

实验1-3农杆菌Ti质粒DNA提取514

实验1-4农杆菌双元载体中Mini-Ti质粒DNA提取517

实验1-5Ml3噬菌体DNA的提取518

实验1-6大肠杆菌染色体DNA提取519

实验1-7cDNA合成及cDNA文库构建520

实验1-8目的基因的PCR扩增524

实验1-9mRNA差别显示（DDRT-PCR）525

实验1-10DNA序列测定527

实验1-11目的基因与载体的限制性酶切及连接532

实验1-12质粒DNA转化大肠杆菌537

实验1-13菌落原位杂交538

实验1-14重组DNA质粒的快速抽提检测539

实验1-15根癌农杆菌Ti质粒的接合转移541

实验1-16抗生素抗性标记基因引入Ti质粒544

实验1-17中间载体的构建544

实验1-18三亲交配法将中间载体质粒导入农杆菌546

实验1-19DNA直接导入农杆菌547

实验1-20中间表达载体构建549

第二部分 目的基因的转化550

实验2-1根癌农杆菌整体植株及离体器官接种诱发冠瘿瘤550

实验2-3农杆菌叶盘法转化552

实验2-2冠瘿瘤的离体培养及植株再生552

实验2-4悬浮细胞与农杆菌共培养转化555

实验2-5原生质体与农杆菌共培养转化556

实验2-6发根农杆菌整体植株接种及离体器官共培养诱导毛状根558

实验2-7毛状根的离体培养及植株再生558

实验2-8发根农杆菌介导的目的基因转化560

实验2-9病毒介导外源基因转化560

实验2-10基因枪转化外源基因562

实验2-11PEG介导基因转化564

实验2-12电激诱导基因转化565

实验2-13显微注射导入外源基因566

实验2-14激光转化外源基因568

实验2-15超声波转化外源基因569

实验2-16脂质体转化外源基因571

实验2-17花粉粒媒体介导外源基因转化574

实验2-18子房注射导入外源基因576

实验2-19穗鞘腔浸泡导入外源基因576

实验2-20种子浸泡导入外源基因576

第三部分 转基因植物的检测技术578

实验3-1冠瘿碱检测578

实验3-2Npt-Ⅱ活性检测580

实验3-3Gus活性检测585

实验3-4Cat活性检测590

实验3-5PAT活性检测593

实验3-6DHFR活性检测594

实验3-7荧光素酶活性检测595

实验3-8植物总核酸提取597

实验3-9植物总DNA提取598

实验3-10植物核DNA提取602

实验3-11植物细胞器DNA提取605

实验3-12植物总RNA提取608

实验3-13总RNA中mRNA的分离610

实验3-14核酸提取物纯度及浓度检测611

实验3-15转基因植物的Southern杂交鉴定614

实验3-16外源基因整合的PCR检测624

实验3-17外源基因整合的PCR-Southern杂交检测625

实验3-18外源基因整合的原位杂交625

实验3-19外源基因表达的Northern杂交检测627

实验3-20外源基因表达的RT-PCR检测630

实验3-21外源基因表达的ELISA检测631

实验3-22外源基因表达的Western印迹分析634

附录638