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第1章 蛋白质纯化和定性的策略1

1.1 单元蛋白质纯化和定性概述1

目标和研究对象1

蛋白质纯化的原料2

蛋白质的检测和分析3

蛋白质分离和纯化方法3

蛋白质产物的定性4

蛋白质纯化实验室5

1.2 单元蛋白质纯化流程图6

可溶性重组蛋白6

不可溶性重组蛋白7

可溶性非重组蛋白8

膜相关的和不可溶性重组蛋白10

第2章 计算分析12

2.1 单元用于蛋白质序列分析的疏水分布图12

方法学13

应用14

结论16

2.2 单元蛋白质二级结构预测17

二级结构预测的方法17

二级结构预测方法的应用20

2.3 单元使用BLAST程序家族进行序列相似性搜索22

进入BLAST程序和文档22

BLAST介绍22

BLAST程序24

2.4 单元因特网上的蛋白质数据库27

蛋白质结构数据库28

蛋白质家族数据库29

2.5 单元蛋白质三级结构预测30

同源性建模31

序列分布图法32

线程法33

从头结构预测33

2.6 单元蛋白质三级结构建模34

词汇34

进入SwissModel程序和文档34

ExPDB数据库35

创建首次法建模查询的格式35

观看SwissModel结果36

2.7 单元比较蛋白质结构预测36

比较建模的步骤36

第3章 检测和分析方法41

3.1 单元分光光度法确定蛋白质浓度42

基本方案1计算一个蛋白质的摩尔吸收系数42

基本方案2折叠蛋白质摩尔吸收系数的测定42

基本方案3使用摩尔吸收系数通过吸收光谱测定蛋白质的浓度43

基本方案4通过205 nm处的吸收光谱测定蛋白质的浓度43

基本方案5粗蛋白质提取液总蛋白质浓度的测定44

3.2 单元定量氨基酸分析45

样品制备45

平均组成的计算45

3.3 单元肽和蛋白质的体外放射标记47

基本方案1使用碘珠对酪氨酸或组氨酸残基进行碘化47

备择方案1用氯胺T或Iodogen在酪氨酸或组氨酸残基碘化49

备择方案2使用乳酸过氧化物酶在酪氨酸或组氨酸残基碘化49

辅助方案1等摩尔碘化以获得产物的高收率50

辅助方案2用HPLC从碘化产物中分离未标记的肽50

基本方案2用Bolton-Hunter试剂在赖氨酸残基或N端碘化51

基本方案3通过酸酐乙酰化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记52

备择方案3通过还原性烷基化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记53

备择方案4用碘乙酸或碘乙酰胺在赖氨酸残基进行14C或3H标记54

基本方案4在肽合成过程中引入标记的氨基酸残基54

备择方案5在肽合成过程中在N端进行选择性标记55

3.4 单元总蛋白质的分析56

基本方案1总蛋白质定量的双缩脲分析57

基本方案2总蛋白质定量的Hartree-Lowry分析57

基本方案3总蛋白质定量的二喹啉甲酸（BCA）分析58

基本方案4总蛋白质定量的酸消化——茚三酮法58

辅助方案1热封玻璃管59

基本方案5测量总蛋白质的考马斯染料结合分析（Bradford分析）60

辅助方案2蛋白质样品的凝胶透析60

辅助方案3蛋白质样品的三氯醋酸沉淀61

3.5 单元溶液中和细胞表面上蛋白质的生物素化62

基本方案1将生物素共价连接到赖氨酸上62

基本方案2将生物素共价连接到巯基上63

辅助方案1二硫键的还原64

辅助方案2生物素化蛋白质的检测64

3.6 单元用氨基酸进行代谢标记65

基本方案用［35S］甲硫氨酸对悬浮细胞进行脉冲标记65

备择方案1用［35S］甲硫氨酸对贴壁细胞进行脉冲标记66

备择方案2用［35S］甲硫氨酸对细胞进行脉冲追踪标记67

备择方案3用［35S］甲硫氨酸对细胞进行长期标记67

辅助方案用TCA沉淀确定标记掺入67

第4章 提取、稳定和浓缩69

4.1 单元用透析和超滤法脱盐、浓缩和更换缓冲液69

基本方案1用再生纤维素透析袋进行脱盐、浓缩和更换缓冲液69

基本方案2用不对称圆盘膜超滤进行浓缩或透析71

备择方案1用切向流超滤进行渗滤或浓缩73

备择方案2用离心式超滤器进行微量浓缩和脱盐74

4.2 单元蛋白质的选择性沉淀75

策略设计75

基本方案1用盐析选择性沉淀76

备择方案1用分步盐析选择性沉淀78

基本方案2用等离子沉淀选择性沉淀：柱法78

备择方案2用等离子沉淀选择性沉淀：透析法80

基本方案3使用C4和C5有机共溶剂选择性沉淀80

基本方案4使用蛋白质排阻和拥挤剂及渗透物选择性沉淀81

基本方案5使用合成的和半合成的聚合电解质选择性沉淀82

基本方案6使用金属和多酚杂多阴离子选择性沉淀83

4.3 单元蛋白质的长期保存84

蛋白质聚集84

化学降解85

在不冻的水溶液中保存85

以盐析沉淀物的形式保存86

以冻结溶液的形式保存86

以冻干固体的形式保存87

选择适当的保存方法89

蛋白酶的抑制89

第5章 重组蛋白的生产90

5.1 单元在大肠杆菌中生产重组蛋白91

5.2 单元大肠杆菌表达系统的选择92

基本方案1在pL启动子控制下的表达：温度诱导94

基本方案2在trp启动子控制下的表达：化学诱导94

备择方案1在lac/tac启动子控制下的表达95

备择方案2 T7 RNA聚合酶／启动子表达系统95

辅助方案1菌株保存96

辅助方案2 SDS-PAGE分析样品的制备96

辅助方案3可溶性分析97

辅助方案4周质提取物的制备97

辅助方案5细胞外培养基样品的制备98

5.3 单元最适宜于蛋白质生产的大肠杆菌的发酵和生长99

基本方案以分批发酵的方式生产重组蛋白99

备择方案1用重金属衍生物进行重组蛋白的体内标记101

备择方案2重组蛋白的稳定同位素标记102

辅助方案1监测生长103

辅助方案2检查无菌度103

5.4 单元在杆状病毒系统中的蛋白质表达103

基本方案1病毒贮液的大规模生产104

基本方案2表达动力学的确定105

基本方案3在生物反应器中生产106

备择方案用灌注培养生产107

辅助方案收获108

5.5 单元用于生产外源蛋白质的酵母培养108

基本方案1使用酿酒酵母半乳糖调控的载体小规模表达109

备择方案1使用葡萄糖阻抑型ADH2载体表达110

备择方案2使用带糖酵解基因启动子的载体表达110

基本方案2在巴斯德毕赤酵母中小规模表达111

辅助方案蛋白质提取物的小规模制备112

5.6 单元哺乳动物细胞蛋白质表达的概况113

5.7 单元在哺乳动物细胞中生产重组蛋白115

基本方案1用碱裂解／阴离子交换捕获法纯化质粒116

基本方案2用脂质体转染法转染细胞117

基本方案3用遗传霉素（G418）进行新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）的选择118

辅助方案对G418背景敏感性的确定119

基本方案4用氨甲蝶呤（MTX）扩增二氢叶酸还原酶（DHFR）119

基本方案5通过多次传代使悬浮细胞适应生产培养基120

基本方案6细胞在大规模转瓶中以分批的方式生长122

基本方案7细胞在大规模分批反应器中的生长124

备择方案在生物反应器中连续培养细胞的生长125

基本方案8从转瓶培养物和大规模反应器中收获分泌的产物126

基本方案9从转瓶培养物的大规模反应器中收获与细胞相关的产物128

5.8 单元细胞培养物和痘病毒贮液的制备128

基本方案1单层细胞的培养129

基本方案2悬浮细胞的培养130

基本方案3痘病毒贮液的制备131

5.9 单元重组痘病毒的构建132

基本方案1用痘病毒载体转染痘病毒感染的细胞133

基本方案2重组病毒噬斑的选择和筛选136

基本方案3噬斑的扩增138

5.10 单元细胞蛋白质表达系统的选择139

5.11 单元使用Gateway系统在多种宿主中进行蛋白质表达143

第6章 重组蛋白的纯化147

6.1 单元在大肠杆菌中生产的重组蛋白的纯化概述149

确定溶解度150

蛋白质定位151

分离可溶性蛋白质153

分离不可溶性蛋白质153

6.2 单元从大肠杆菌中制备可溶性蛋白质155

基本方案在大肠杆菌中可溶性表达的一种蛋白质：白细胞介素1β的纯化156

6.3 单元从大肠杆菌中制备和提取不溶性（包含体）蛋白质161

基本方案1从大肠杆菌中制备和提取不溶性（包含体）蛋白质161

基本方案2在盐酸胍存在的情况下进行中压凝胶过滤层析162

6.4 单元蛋白质折叠概述164

蛋白质是怎样折叠的164

怎样折叠蛋白质166

6.5 单元大肠杆菌不溶性（包含体）蛋白质的折叠和纯化170

基本方案1牛生长激素的折叠和纯化170

基本方案2人白细胞介素2的折叠和纯化173

基本方案3带组氨酸标签蛋白质的折叠和纯化：HIV-1整合酶174

6.6 单元GST融合蛋白的表达和纯化177

基本方案1谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的表达178

基本方案2可溶性GST融合蛋白的亲和层析纯化179

备择方案用亲和层析从包含体中纯化GST融合蛋白181

基本方案3蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去GST亲和标签181

6.7 单元硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化182

基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达182

辅助方案硫氧还蛋白融合蛋白的渗透压释放185

第7章 重组蛋白的定性186

7.1 单元重组蛋白定性概述188

7.2 单元用紫外吸收光谱法测定重组蛋白的一致性和纯度190

基本方案用近紫外光谱法分析蛋白质190

7.3 单元测定重组蛋白的一致性和结构194

基本方案测定重组蛋白的二硫键模式194

7.4 单元横向尿素梯度电泳197

基本方案197

7.5 单元分析型超速离心200

7.6 单元测定蛋白质的圆二色谱201

基本方案记录CD谱203

辅助方案远紫外CD谱的解释205

7.7 单元测定蛋白质的荧光光谱法205

基本方案记录荧光发射光谱207

7.8 单元用差示扫描量热法测量蛋白质的热稳定性209

基本方案差示扫描量热法209

辅助方案1电校准211

辅助方案2用碳氢化合物胶囊进行温度校准211

辅助方案3用脂悬液进行温度校准211

辅助方案4 DSC比色杯的维护和清洁211

7.9 单元用HPLC凝胶过滤和质谱法对蛋白质进行定性212

策略设计212

基本方案重组蛋白的HPLC分析214

辅助方案重组蛋白的MALDI-MS分析215

第8章 常规层析分离217

8.1 单元常规层析概述217

目的蛋白的收率和纯度217

纯化策略的步骤219

影响层析分辨率的参数220

8.2 单元离子交换层析224

策略设计224

基本方案1批量吸附和逐步提高盐浓度的梯度洗脱227

备择方案基于pH的分步梯度洗脱228

基本方案2线性梯度洗脱的柱层析229

辅助方案1用试管预试验确定离子交换层析的起始条件230

辅助方案2离子交换柱动态（柱）容量和处理容量的测量232

辅助方案3梯度形成技术232

辅助方案4离子交换介质的清洗和再生233

辅助方案5离子交换介质的保存233

8.3 单元凝胶过滤层析234

策略设计234

基本方案1脱盐（分组分离）235

基本方案2蛋白质分级分离239

基本方案3测定分子大小239

备择方案柱校准240

8.4 单元疏水相互作用层析241

策略设计241

基本方案1用胶珠≥90 μm的HIC介质装柱243

备择方案用胶珠≤34μm的HIC介质装柱244

基本方案2测试装填的柱床244

基本方案3从HIC柱上洗脱蛋白质246

辅助方案HIC柱的再生、清洁和贮存246

8.5 单元肽和蛋白质的HPLC248

启动程序248

HP-SEC的标准操作条件253

HP-NPC的标准操作条件253

HP-HIC的标准操作条件254

HP-IEX的标准操作条件254

H P-HILIC的标准操作条件255

H P-IMAC的标准操作条件256

H P-BAC的标准操作条件256

RP-HPLC的标准操作条件257

用RP-HPLC技术对肽和蛋白质混合物进行脱盐处理259

RP-HPLC方法的建立259

第9章 亲和层析261

9.1 单元凝集素亲和层析263

基本方案Con A-Sepharose亲和层析263

辅助方案确定凝集素结合和洗脱条件的预实验265

备择方案麦胚凝集素（WGA）-Agarose亲和层析266

9.2 单元染料亲和层析266

基本方案1用层析法选择各成分266

基本方案2阴性层析268

基本方案3使用分步洗脱的阳性层析269

辅助方案活性染料的固定化269

9.3 单元天然配体的亲和纯化271

基本方案CNBr活化271

备择方案1用对硝基苯基氯甲酸酯活化273

备择方案2用2，2，2-三氟乙烷基磺酰氯活化274

9.4 单元金属螯合亲和层析（MCAC）275

策略设计275

基本方案用于纯化可溶性带组氨酸尾融合蛋白的非变性MCAC275

备择方案1用于纯化不溶性带组氨酸尾的融合蛋白的变性MCAC277

备择方案2 MCAC纯化后蛋白质的固相复性278

辅助方案1纯化后蛋白质的分析和处理279

辅助方案2 NTA树脂的再生279

9.5 单元免疫亲和层析280

基本方案可溶性或膜结合抗原的分离280

备择方案1抗原的低pH洗脱282

备择方案2抗原的批量纯化282

备择方案3辛基β-D-葡萄糖苷的洗脱283

辅助方案抗体-Sepharose的制备283

9.6 单元免疫沉淀284

基本方案1用非变性去污剂溶液裂解的细胞悬液进行免疫沉淀284

基本方案2免疫沉淀再捕获289

第10章 电泳291

10.1 单元蛋白质的单向SDS凝胶电泳292

电流和电泳292

基本方案变性（SDS）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：Laemmli法294

备择方案1在Tris-Tricine缓冲液系统中电泳297

备择方案2在梯度凝胶中分离蛋白质298

辅助方案灌制多块梯度胶301

10.2 单元非变性条件的单向凝胶电泳303

基本方案非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳303

备择方案非变性不连续电泳和分子质量标准曲线（Ferguson曲线）的制作307

10.3 单元双向凝胶电泳309

基本方案1应用固相pH梯度凝胶条进行等电聚焦309

基本方案2 IPG凝胶的第二向电泳312

备择方案对角线凝胶电泳（非还原／还原凝胶）313

10.4 单元利用固定法检测凝胶中的蛋白质314

基本方案1考马斯亮蓝R-250染色315

备择方案1快速考马斯亮蓝G-250染色316

备择方案2酸性考马斯亮蓝G-250染色317

基本方案2 SYPRO Ruby染色317

基本方案3银染318

备择方案3非氨盐银染319

备择方案4快速银染320

辅助方案凝胶成像321

10.5 单元聚丙烯酰胺凝胶电印迹322

基本方案电印迹到PVDF膜上322

备择方案1用于序列分析的蛋白质电印迹324

备择方案2电印迹至硝酸纤维素膜上325

备择方案3在半干系统中的蛋白质电印迹325

10.6 单元检测印迹膜上的蛋白质327

基本方案1氨基黑染色327

基本方案2考马斯亮蓝R-250染色328

基本方案3丽春红S染色328

基本方案4胶体金染色329

基本方案5胶体银染色329

基本方案6印度墨汁染色330

基本方案7荧光胺标记330

10.7 单元免疫印迹检测331

基本方案使用直接耦联的第二抗体进行免疫探测331

备择方案用耦联到第二抗体上的抗生物素蛋白生物素进行免疫探测332

辅助方案1用发色底物显迹333

辅助方案2用发光底物显迹334

第11章 化学分析336

11.1 单元溶液中蛋白质的酶解336

基本方案非变性条件下的蛋白质消化336

备择方案1尿素或盐酸胍溶液中的蛋白质消化339

备择方案2 SDS溶液中的蛋白质消化340

辅助方案1酶贮液的制备和使用341

辅助方案2消化混合物中肽的还原和S-烷基化344

11.2 单元在PVDF膜上酶解蛋白质345

基本方案在氢化Triton X-100缓冲液中消化结合在PVDF膜上的蛋白质345

11.3 单元测序用蛋白质的胶中消化347

基本方案在含Tween 20的胶中消化蛋白质347

备择方案1在含十二烷基磺酸钠的凝胶中消化蛋白质349

备择方案2在不含去污剂的凝胶中消化蛋白质350

11.4 单元溶液中蛋白质的化学切割350

基本方案1用溴化氰从甲硫氨酸残基的C端切割351

基本方案2用BNPS-3-甲基吲哚切割色氨酸残基的C端352

基本方案3用甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肽键352

基本方案4用羟胺切割天冬酰胺甘氨酸肽键353

基本方案5用NTCB切割半胱氨酸残基的N端353

11.5 单元膜上蛋白质的化学切割354

基本方案1用溴化氰切割甲硫氨酸残基的C端355

备择方案用溴化氰切割Edman降解法分析过的结合在PVDF膜上的蛋白质355

基本方案2 BMPS-3-甲基吲哚法切割色氨酸残基的C端356

基本方案3甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肽键357

基本方案4用羟胺切割天冬酰胺甘氨酸肽键357

基本方案5用NTCB切割半胱氨酸的N端357

11.6 单元反相HPLC分离肽358

基本方案1用反相HPLC分离5～500 pmol的肽358

基本方案2用反相HPLC分离≤5 pmol的肽360

辅助方案毛细管HPLC系统的组装360

11.7 单元N端序列分析362

仪器使用362

样品制备363

第12章 翻译后修饰：糖基化367

12.1 单元N-糖基化的抑制367

基本方案N-糖基化的抑制367

辅助方案丙酮沉淀371

12.2 单元 N-连接寡糖的内切糖苷酶和糖胺酶的释放372

基本方案1内切糖苷酶H消化372

基本方案2肽：N-糖苷酶F消化373

辅助方案估测糖蛋白中N-连接寡糖链的数目374

基本方案3唾液酸酶（sialidase或neuraminidase）消化374

12.3 单元蛋白质上糖磷脂锚的检测375

基本方案1用Triton X-114对细胞或膜总蛋白质进行提取和分级分离375

备择方案用Triton X-114对所获蛋白质进行分级分离376

基本方案2通过完整细胞的PI-PLC消化鉴定GPI锚定的蛋白质376

第13章 翻译后修饰：磷酸化和磷酸酶378

13.1 单元用32Pi标记培养细胞及制备用于免疫沉淀的细胞裂解物379

基本方案用32Pi标记培养细胞及用温和去污剂裂解379

备择方案在SDS中煮沸裂解细胞380

13.2 单元磷酸氨基酸的分析381

基本方案利用酸水解和双向电泳法分析磷酸氨基酸381

备择方案碱处理以增强点在滤膜上的含磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸的蛋白质的检测383

13.3 单元用免疫学技术检测磷酸化385

基本方案用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹及用［125I］蛋白A进行检测385

备择方案用增强化学发光（ECL）检测结合的抗体386

13.4 单元用酶学技术检测磷酸化387

基本方案1用非特异性酸性磷酸酶消化磷蛋白388

备择方案1用非特异性碱性磷酸酶消化磷蛋白388

基本方案2用蛋白丝氨酸／苏氨酸磷酸酶消化磷蛋白389

备择方案2用蛋白酪氨酸磷酸酶消化磷蛋白389

13.5 单元用透化处理的策略研究蛋白质的磷酸化390

基本方案在透化处理的细胞中分析蛋白质的磷酸化390

13.6 单元磷酸肽作图及磷酸化位点的鉴定392

基本方案SDS-PAGE分离的蛋白质经胰蛋白酶水解后进行磷酸肽作图392

备择方案固定化蛋白质的水解消化397

辅助方案用于微量序列测定或质谱分析的磷酸肽的制备398

第14章 翻译后修饰：特定的应用400

14.1 单元二硫键形成的分析400

基本方案在完整单层细胞中分析二硫键的形成401

备择方案在悬浮细胞中分析二硫键的形成402

14.2 单元蛋白质酰化的分析402

基本方案1用脂肪酸进行生物合成标记403

基本方案2脂肪酸连接到蛋白质的分析404

基本方案3细胞提取物中总蛋白质结合的脂肪酸标记的分析404

基本方案4脂肪酸标记一致性的分析406

14.3 单元蛋白质异戊烯化和羧甲基化的分析406

基本方案1培养细胞中蛋白质的异戊烯化406

基本方案2培养细胞中蛋白质的羧甲基化407

14.4 单元蛋白质氧化修饰的分析408

基本方案1用2，4-二硝基苯肼对蛋白质羰基进行分光光度定量408

基本方案2用氚标记的硼氢化钠定量蛋白质羰基衍生物409

基本方案3凝胶电泳分析［14C］碘乙酰胺标记的蛋白质巯基410

基本方案4用质谱定量蛋白质的二酪氨酸残基411

辅助方案1 O，O′-二酪氨酸标准品的制备412

辅助方案2用竞争性ELISA分析蛋白质结合的硝基酪氨酸413

基本方案5异天冬氨酸形成的酶学分析414

14.5 单元蛋白质泛素化的分析415

基本方案1目的蛋白的免疫沉淀及随后的抗Ub免疫印迹415

基本方案2从表达His6-Ub的细胞中亲和纯化泛素化的蛋白质416

第15章 蛋白质的化学修饰419

15.1 单元半胱氨酸的修饰420

策略设计420

基本方案1用酰卤试剂（haloacyl reagent）或N-乙基马来酰亚胺对已知大小和组成的蛋白质进行烷基化421

基本方案2用N-碘乙基三氟乙酰胺进行烷基化422

基本方案3用丙烯酰胺进行烷基化423

基本方案4二硫化物的空气氧化423

辅助方案1比色法定量游离巯基423

辅助方案2半胱氨酸修饰后的样品脱盐424

15.2 单元氨基的修饰425

策略设计428

基本方案1用琥珀酰亚胺酯进行酰胺化429

基本方案2异硫氰酸荧光素的加入429

基本方案3琥珀酰化430

基本方案4还原性甲基化430

第16章 质谱432

16.1 单元肽和蛋白质质谱分析综述433

在蛋白质结构分析中，为什么质谱是一种必需的工具？433

什么是MS？434

什么是串联质谱？434

MS数据能够定量吗？435

样品制备436

质量测定准确性和质量分辨率的基本原理437

16.2 单元肽和蛋白质MALDI质量分析用样品的制备438

基本方案1干滴法440

基本方案2快速蒸发法440

辅助方案HCCA的纯化／重结晶441

16.3 单元用于MALD-MS指纹图蛋白质的凝胶内消化441

基本方案441

16.4 单元在网上搜索序列数据库：用MS-Fit鉴定蛋白质442

基本方案442

16.5 单元在网上搜索序列数据库：用MS-Tag鉴定蛋白质444

基本方案444

16.6 单元使用纳升喷雾连接装置将样品直接导入电喷雾离子化质谱仪中444

16.7 单元使用微型毛细管液相色谱将样品直接导入电喷雾离子化质谱仪中446

基本方案1制作集成式LC柱ES针头446

基本方案2装配ES针头447

基本方案3微量ES LC/MS连接总成的安装和使用448

16.8 单元用四极杆离子阱质谱和SEQUEST数据库匹配鉴定蛋白质449

基本方案449

16.9 单元通过手工解释MS/MS谱进行从头肽测序450

基本方案MS/MS谱的手工解释450

辅助方案1通过甲基酯化证实新测定的序列454

辅助方案2通过乙酰化证实新测定的序列454

第17章 肽的制备和处理456

17.1 单元在塑料针上合成多种肽456

基本方案肽的多合成针合成456

辅助方案1制备活化的Fmoc保护的氨基酸溶液460

辅助方案2肽的N端乙酰化460

辅助方案3肽的N端生物素化461

17.2 单元用于生产识别完整蛋白质的抗体的合成肽461

基本方案1计算机辅助选择适当的抗原肽序列461

备择方案1手工检查以选择合适的肽序列462

基本方案2设计用于耦联到载体蛋白质上的合成肽463

备择方案2设计一种合成的多抗原肽463

基本方案3使用异型双功能交联剂将合成肽耦联到载体蛋白质上463

辅助方案1用Ellman试剂分析游离的巯基464

辅助方案2还原肽中的半胱氨酸基团466

备择方案3使用同型双功能试剂将合成的肽耦联到载体蛋白质上466

备择方案4使用碳二亚胺将合成肽耦联到载体蛋白质上466

辅助方案3肽与载体蛋白质摩尔比率的计算467

17.3 单元作为蛋白质模拟物的肽树枝状高分子的合成和应用468

基本方案1 MAP系统的直接Bos合成469

备择方案直接Fmoc固相合成MAP系统472

辅助方案1茚三酮试验474

辅助方案2用透析法纯化MAP系统474

辅助方案3使用高效凝胶过滤层析纯化MAP475

基本方案2末端加到侧链上的cMAP的直接合成475

17.4 单元肽二硫键的形成477

基本方案1用空气氧化促进二硫键的形成477

备择方案1通过在树脂上空气氧化促进二硫键的形成477

备择方案2活性炭／空气介导的分子内二硫化物的形成478

基本方案2通过铁氰化钾氧化形成分子内二硫化物478

备择方案3通过铁氰化钾氧化形成分子间或分子内二硫化物479

备择方案4通过铁氰化钾氧化在树脂上形成二硫化物479

基本方案3在弱酸性pH条件下用DMSO氧化479

备择方案5在弱碱性pH条件下用DMSO氧化480

基本方案4用氧化还原缓冲液氧化480

基本方案5由固相Ellman试剂介导的氧化480

基本方案6用碘同时去保护／氧化482

备择方案6用碘在树脂上同时进行S-ACM去保护／氧化482

基本方案7用Tl（Ⅲ）同时进行S-ACM去保护／氧化483

备择方案7用Tl（Ⅲ）在树脂上同时进行S-ACM去保护／氧化483

基本方案8烷基三氯硅烷亚砜氧化484

第18章 蛋白质互相作用的鉴定485

18.1 单元蛋白质蛋白质相互作用的分析485

基本概念485

平衡参数486

动力学参数487

18.2 单元用相互作用阱／双杂交系统鉴定相互作用的蛋白质489

18.3 单元用基于噬菌体的表达克隆鉴定相互作用的蛋白质497

策略设计497

18.4 单元用共沉淀法检测蛋白质蛋白质相互作用498

基本方案与蛋白A-Sepharose或蛋白G-Sepharose共沉淀的蛋白质499

备择方案GST融合蛋白的共沉淀499

18.5 单元用酵母双杂交芯片高通量筛选蛋白质-蛋白质相互作用500

基本方案1蛋白质组规模的酵母蛋白质芯片的制备500

基本方案2用酵母蛋白质芯片对蛋白质相互作用进行手工筛选502

18.6 单元用far Western分析鉴定蛋白质的相互作用503

基本方案蛋白质混合物的farWestern分析504

备择方案1用免疫印迹检测相互作用的蛋白质505

备择方案2在far Western印迹中用肽鉴定特异性的相互作用序列505

18.7 单元用于研究生物分子相互作用的闪烁邻近分析法（SPA）506

第19章 蛋白质相互作用的定量509

19.1 单元蛋白质相互作用定量的概述509

表面等离子共振510

分析型超速离心（沉降平衡和沉降速度）513

19.2 单元滴定量热法（titration calorimetry）513

基本方案1用恒温滴定微量量热法确定摩尔比率、观察的亲和力（Kobs d）和观察的结合焓的变化（△Hobs）514

基本方案2用ITC确定生物化学结合热力学：△Go′、△Ho′和△Co′p518

19.3 单元用于测量蛋白质缔合平衡的缩比大区带分析型凝胶过滤层析519

基本方案缩比大区带分析型凝胶过滤层析519

辅助方案1数据分析521

辅助方案2蛋白质装配过程的动量学和化学计量的确定522

单体二聚体平衡缔合测量数据的调整523

19.4 单元带在线式光散射的分子排阻层析523

基本方案1使用折射率和光散射计算不含碳水化合物蛋白质的分子质量和自缔合程度（双检测器法）523

备择方案1合用光散射检测器和紫外检测器来计算非糖基化蛋白质的分子质量（双检测器法）524

备择方案2用于大蛋白质的分子排阻层析和光散射：DEBYE分析525

备择方案3绝对分子质量校准法525

基本方案2使用光散射和反射率计算不含碳水化合物的蛋白质蛋白质复合物的化学计量525

备择方案4使用光散射和紫外计算糖蛋白的蛋白质蛋白质相互作用的化学计量526

第20章 肽酶527

20.1 单元蛋白酶527

蛋白酶的生物学重要性527

蛋白酶的命名法528

可有效地细分许多蛋白酶的3种方式528

20.2 单元酿酒酵母蛋白酶体的纯化和定性537

基本方案1用阴离子交换层析和凝胶过滤纯化酵母26S蛋白酶体537

备择方案用亲和层析纯化酵母26S蛋白酶体538

基本方案2用常规层析纯化酵母20S蛋白酶体539

辅助方案1 26S和20S蛋白酶体肽酶活性的分析540

辅助方案2多聚泛素化溶菌酶的制备540

辅助方案3放射性标记酪蛋白的制备543

辅助方案4用26S蛋白酶体降解蛋白质底物543

辅助方案5蛋白酶体的非变性凝胶电泳／胶内肽酶分析543

20.3 单元真核生物20S蛋白酶体的纯化544

基本方案从牛脑垂体纯化20S蛋白酶体544

辅助方案分析蛋白酶体催化的切割的酶分析法547

20.4 单元丝氨酸蛋白酶抑制剂548

基本方案1用柱层析纯化人抗凝血酶548

辅助方案洗脱组分中抗凝血酶的分析550

基本方案2在无糖胺聚糖存在的情况下分析抗凝血酶抑制——“递增的抗凝血酶活性”550

基本方案3在糖胺聚糖存在的情况下分析抗凝血酶抑制——“肝素辅因子活性”551

20.5 单元用GFP作为报道蛋白分析序列特异性蛋白酶552

基本方案位点特异性蛋白酶的荧光分析552

辅助方案用金属螯合层析纯化底物-GFP融合蛋白553

备择方案位点特异性蛋白酶的荧光共振能量转移分析554

20.6 单元活性丝氨酸蛋白酶及其变异体的过表达和从大肠杆菌包含体中的纯化555

基本方案1微小纤溶酶原及其变异体的过表达和从大肠杆菌包含体中的纯化555

基本方案2微小纤溶酶原的激活及具有催化活性微小纤溶酶的纯化557

辅助方案1确定重组微小纤溶酶活性的分析方法557

辅助方案2确定活性位点浓度的分析方法558

20.7 单元在细胞环境中分析蛋白酶559

基本方案1用细胞渗透性肽底物原位监测细胞内蛋白酶的活性559

基本方案2通过自溶激活和内源底物蛋白质降解原位监测细胞内蛋白酶活性560

基本方案3监测细胞裂解物反映出的蛋白酶活性水平561

基本方案4原位监测分泌的蛋白酶活性562

基本方案5用酶谱法测量细胞分泌的MMP活性563

20.8 单元caspase的表达、纯化和定性564

基本方案1 caspase在大肠杆菌中的表达564

基本方案2 caspase酶分析567

辅助方案1重组caspase的滴定568

辅助方案2 caspase底物的制备568

第21章 基于凝胶的蛋白质组分析570

21.1 单元使用双向差异凝胶电泳（2-D DIGE）确定蛋白质谱570

基本方案用花青染料（CyDye DIGE荧光素）标记蛋白质用于双向电泳570

辅助方案用于Cy标记反应的蛋白质的制备573

备择方案用质谱技术鉴定DIGE胶中的蛋白质574

21.2 单元用于蛋白质组分析的激光捕获显微分离技术575

基本方案1激光捕获显微分离技术（LCM）575

备择方案LCM组织切片的免疫标记576

辅助方案1 LCM分析用组织的收集和保存577

辅助方案2使用SYPRO RUBY染料对LCM捕获材料中的蛋白质进行定量578

基本方案2使用免疫印迹分析LCM捕获的材料578

基本方案3 SELDI质谱579

附录1 试剂和溶液582

附录2 常用的度量制和数据651

附录3 常用技术673

附录3A 蛋白质折叠剂的使用673

附录3B 透析676

附录3C 玻璃器具硅烷化678

附录3D 使用硫酸铵的蛋白质沉淀679

附录3E 琼脂糖凝胶电泳685

附录3F 用吸收光谱法进行核酸定量686

附录4 试剂和设备供货商689

参考文献734

索引748