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1 绪论1

1.1 基因及其结构2

1.1.1 基因与性状2

1.1.2 原核生物基因结构3

1.1.3 真核生物基因结构4

1.2 基因表达调控6

1.2.1 原核生物基因表达调控6

1.2.2 真核生物基因表达调控8

1.2.3 基因表达调控的生物学意义17

1.3 基因工程及其研究内容18

1.3.1 基因工程概念18

1.3.2 研究内容18

1.4 基因工程发展简史19

1.4.1 基因工程的理论支撑19

1.4.2 基因工程工具酶与载体的发现19

1.4.3 基因工程的诞生20

1.4.4 基因工程技术的发展20

1.5 基因工程应用展望21

1.5.1 基因工程表达技术的发展21

1.5.2 带有新性状的转基因生物的创造21

1.5.3 基因工程新产品的问世21

1.5.4 数量性状的基因工程改良与基因组工程21

1.5.5 基因检测与基因治疗的应用21

1.5.6 基因工程安全性的提高22

2 基因工程载体23

2.1 概述24

2.1.1 基因工程载体的概念24

2.1.2 基因工程载体的分类25

2.1.3 基因工程载体的遗传选择标记25

2.2 质粒25

2.2.1 概述25

2.2.2 质粒的类型26

2.2.3 基因工程中常用的质粒26

2.3 λ噬菌体载体28

2.4 柯斯载体30

2.5 噬菌体质粒31

2.6 单链DNA噬菌体载体32

2.7 酵母载体32

2.8 真核病毒载体33

2.8.1 牛乳头瘤病毒载体33

2.8.2 猿猴空泡病毒载体33

2.8.3 反转录病毒载体34

2.8.4 痘病毒载体35

2.9 昆虫杆状病毒载体35

3 基因操作的工具酶37

3.1 DNA操作酶的类型38

3.2 DNA限制性内切酶38

3.2.1 DNA限制性内切酶的发现与命名39

3.2.2 DNA限制性内切酶的识别序列与切割产物39

3.2.3 DNA限制性内切酶的酶切反应40

3.3 连接酶40

3.3.1 DNA连接酶的种类41

3.3.2 DNA末端（黏末端和平末端）连接41

3.3.3 RNA连接酶41

3.4 DNA聚合酶42

3.4.1 大肠杆菌DNA聚合酶I与Klenow酶42

3.4.2 Taq DNA聚合酶43

3.4.3 T4噬菌体DNA聚合酶43

3.4.4 T7噬菌体DNA聚合酶43

3.4.5 末端转移酶43

3.5 反转录酶44

3.5.1 AMV反转录酶44

3.5.2 M-MLV反转录酶44

3.5.3 HIV-1反转录酶44

3.6 核酸酶45

3.6.1 核酸内切酶45

3.6.2 核酸外切酶46

3.6.3 其他核酸酶47

3.7 DNA修饰酶47

3.7.1 DNA激酶47

3.7.2 DNA甲基转移酶47

3.7.3 磷酸酶48

3.8 重组酶49

3.8.1 Cre重组酶49

3.8.2 Hin重组酶49

3.8.3 RecA/RAD5150

3.8.4 Tre重组酶50

3.8.5 Flp重组酶50

3.9 DNA修复酶50

3.9.1 DNA糖苷酶50

3.9.2 损伤修复相关的核酸内切酶52

4 DNA的提取与纯化55

4.1 质粒DNA的制备56

4.1.1 质粒DNA制备的基本原理56

4.1.2 质粒DNA制备的常见方法58

4.2 噬菌体DNA的制备61

4.2.1 λ噬菌体DNA的分离纯化61

4.2.2 M13噬菌体DNA的分离纯化62

4.3 基因组DNA的制备63

4.3.1 细菌基因组DNA的制备63

4.3.2 植物基因组DNA的制备64

4.3.3 哺乳动物基因组DNA的制备65

4.4 DNA的定量和纯度测定66

4.4.1 紫外光谱分析法66

4.4.2 荧光分光光度法66

4.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测法67

5 基因检测与分析69

5.1 DNA 测序技术70

5.1.1 Sanger链终止法测序71

5.1.2 Illumina（Solexa）测序71

5.1.3 454焦磷酸测序Ion Torrent半导体测序73

5.1.4 SOLiD测序74

5.1.5 单分子测序76

5.2 新一代测序技术的基础计算分析78

5.2.1 无参考序列的从头拼接79

5.2.2 有参考序列的快速序列比对80

5.3 DNA序列高级分析81

5.3.1 DNA序列分析的步骤82

5.3.2 重复序列辨别82

5.3.3 同源性搜索83

5.3.4 基因结构特征分析85

5.3.5 基于基因序列进化分析88

5.4 基因检测技术91

5.4.1 PCR技术91

5.4.2 印迹与杂交95

5.5 功能基因组学分析97

5.5.1 转录组分析技术97

5.5.2 蛋白质组分析技术100

5.5.3 翻译组测序技术103

6 目的基因的获得105

6.1 基于PCR的目的基因克隆方法106

6.1.1 已知完整核苷酸序列的目的基因的获取106

6.1.2 已知完整氨基酸序列的目的基因的获取108

6.1.3 已知部分序列的目的基因的获取108

6.2 化学合成目的基因110

6.3 文库法获得目的基因113

6.3.1 cDNA文库的合成113

6.3.2 从cDNA文库中筛选和鉴定目的基因115

6.4 差异克隆技术116

6.4.1 mRNA差别显示技术116

6.4.2 代表性差异分析118

6.4.3 抑制性消减杂交119

7 体外基因诱变121

7.1 随机突变124

7.1.1 易错PCR诱变124

7.1.2 盒式诱变125

7.1.3 重组介导的随机诱变128

7.1.4 缺失诱变132

7.1.5 插入诱变134

7.1.6 限制性内切酶介导的诱变137

7.1.7 化学诱变138

7.2 定点突变139

7.2.1 PCR介导的定点诱变140

7.2.2 不依赖PCR的定点诱变142

8 重组DNA分子转入大肠杆菌147

8.1 大肠杆菌的转化148

8.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒转化148

8.1.2 对转化细胞的选择150

8.1.3 重组体的鉴定151

8.2 噬菌体DNA转染细菌细胞157

8.2.1 λ噬菌体体外包装157

8.2.2 单链噬菌体转染160

8.2.3 重组噬菌体的筛选方法165

9 真核生物基因调控技术167

9.1 基因过量表达技术169

9.1.1 启动子的选择170

9.1.2 Kozak序列170

9.1.3 密码子偏爱性171

9.1.4 增强子、前导序列与沉默子172

9.2 基因沉默技术173

9.2.1 反义RNA技术173

9.2.2 RNAi技术174

9.2.3 基因共抑制技术176

9.3 基因编辑技术177

9.3.1 基因敲除技术177

9.3.2 基因敲入技术180

9.3.3 TALENs基因靶向修饰181

9.3.4 CRISPR/Cas9技术182

10 细菌基因工程185

10.1 目的基因在大肠杆菌中的表达186

10.1.1 外源基因表达载体186

10.1.2 表达盒与基因融合193

10.1.3 在大肠杆菌中表达重组蛋白存在的问题195

10.2 细菌基因工程的应用197

10.2.1 基因工程药物197

10.2.2 酶制剂199

10.2.3 氨基酸200

10.2.4 生物基有机酸、醇200

10.3 其他细菌基因工程201

10.3.1 芽胞杆菌基因工程201

10.3.2 棒状杆菌基因工程203

10.3.3 链霉菌基因工程204

10.3.4 乳酸菌基因工程204

11 真菌基因工程207

11.1 目的基因在酵母中的表达209

11.1.1 常用的酵母表达载体209

11.1.2 酵母宿主214

11.1.3 在酵母中表达重组蛋白存在的问题216

11.2 酵母转化与表达产物鉴定216

11.3 酵母基因工程应用219

11.4 其他真菌基因工程219

12 植物基因工程223

12.1 植物基因工程基本原理224

12.1.1 植物基因的改造及表达载体构建224

12.1.2 植物基因转化227

12.1.3 转基因植物的鉴定232

12.1.4 常用的选择标记与报告基因232

12.1.5 植物安全表达系统233

12.2 植物基因工程应用234

12.2.1 改良农产品品质234

12.2.2 植物抗虫基因工程235

12.2.3 抗除草剂基因工程235

12.2.4 改进逆境适应性235

12.2.5 植物抗病基因工程236

12.2.6 提高农作物产量237

12.2.7 植物生物反应器与产品开发237

12.3 植物基因工程产品种植现状238

13 动物基因工程241

13.1 动物基因工程基本原理242

13.1.1 动物基因工程的分类242

13.1.2 动物基因工程载体246

13.2 基因工程动物的制备248

13.2.1 受精卵原核显微注射法249

13.2.2 利用胚胎干细胞的基因打靶法250

13.2.3 体细胞核移植法251

13.2.4 病毒介导的转基因252

13.3 基因工程动物的鉴定252

13.3.1 基因组水平的检测253

13.3.2 转录水平的检测253

13.3.3 蛋白质表达水平的检测254

13.4 动物细胞基因工程255

13.4.1 动物细胞表达系统特征255

13.4.2 表达载体的结构元件256

13.4.3 人工构建哺乳动物细胞表达载体的原则257

13.4.4 常用的动物细胞表达系统257

13.4.5 动物细胞转染方法257

13.5 动物基因工程应用258

13.5.1 生命科学探索与疾病防治研究的平台258

13.5.2 异种器官移植的来源259

13.5.3 改良动物品种，推动畜牧养殖业发展259

13.5.4 促进功能性食品、药品的生产260

14 病毒基因工程263

14.1 病毒载体264

14.1.1 病毒载体概述264

14.1.2 动物病毒载体265

14.1.3 植物病毒载体270

14.2 病毒基因工程应用273

14.2.1 基因工程病毒疫苗273

14.2.2 病毒与基因治疗276

14.2.3 病毒与生物防治278

14.3 病毒基因工程展望279

15 基因工程产品的分离纯化与检测281

15.1 原材料的预处理与粗分离282

15.1.1 细胞破碎282

15.1.2 粗分离技术284

15.2 层析分离纯化技术285

15.2.1 亲和层析技术286

15.2.2 其他层析技术289

15.3 终产品的制备与检测分析290

15.3.1 终产品的制备与储存290

15.3.2 分离纯化过程中蛋白质检测290

15.3.3 终产物的检测项目与方法290

15.4 基因工程产品胰岛素分离纯化与检测实例292

16 基因工程产品的安全评价与管理295

16.1 基因工程产品的安全性297

16.1.1 基因工程产品的食品安全性297

16.1.2 基因工程产品的生态安全性298

16.1.3 基因工程与伦理道德300

16.1.4 基因工程与动物福利302

16.2 基因工程产品的安全评价303

16.2.1 基因工程产品的安全评价原则303

16.2.2 基因工程食品安全性评价304

16.2.3 基因工程生态安全性评价306

16.3 基因工程产品的安全管理307

16.3.1 国际生物安全管理模式307

16.3.2 中国基因工程产品的安全管理体系308

主要参考文献312