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第1章 细胞培养1

单元1.1 哺乳动物细胞培养的基本方法2

基本方案单层细胞的胰酶消化和传代2

备择方案悬浮培养的细胞传代3

支持方案1人单层贴壁细胞的冻存3

支持方案2悬浮细胞的冻存4

支持方案3人细胞系的解冻与复苏4

支持方案4用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞数目及活性4

支持方案5细胞运输的准备5

单元1.2 适于哺乳动物细胞的培养基6

基本方案1制备含血清的培养基6

基本方案2制备血清减量或无血清培养基7

基本方案3 HAT选择培养基的制备8

基本方案4转化细胞在软琼脂中的生长9

支持方案1培养基中pH的调节9

支持方案2抗生素在培养基中的应用10

单元1.3 细胞培养的无菌技术11

基本方案1无菌技术11

基本方案2层流式超净台的使用12

单元1.4 灭菌和过滤13

基本方案1液体的高压灭菌14

备择方案干燥物品的高压消毒15

基本方案2干热灭菌和清除热原法16

基本方案3消毒剂的应用：70％乙醇16

溶液的过滤除菌17

基本方案4真空过滤17

基本方案5小体积非水溶性液体的正压过滤18

单元1.5 确定和控制细胞培养的微生物污染19

基本方案1细菌和真菌污染的检测19

基本方案2直接培养法检测支原体污染21

基本方案3应用抗生素控制微生物污染23

单元1.6 酵母培养及培养基24

培养基的制备24

酵母培养的综合考虑30

第2章 细胞的制备与分离35

单元2.1 成纤维细胞培养的建立36

基本方案36

单元2.2 人淋巴细胞的制备和培养40

基本方案1 通过高分子质量的蔗糖-泛影钠（Ficoll-Hypaque）梯度离心制备淋巴细胞40

基本方案2从淋巴细胞群里制备单核／巨噬细胞和树突状细胞42

基本方案3通过包被在磁珠表面的单克隆抗体分选T细胞和B细胞42

单元2.3 人脐静脉内皮细胞的制备44

基本方案44

单元2.4 转染EB病毒产生永生的B细胞株45

基本方案45

单元2.5 激光捕获显微切割46

基本方案从组织切片中分离一种纯的细胞群47

支持方案苏木素和伊红染色组织的激光显微切割49

第3章 亚细胞组分分离和细胞器分离50

单元3.1 细胞组分分离概述51

单元3.2 分离大鼠肝细胞质膜片层与浆膜结构域59

基本方案1分离质膜片层59

支持方案1检测碱性磷酸二酯酶Ⅰ的活性61

基本方案2分离质膜结构域63

支持方案2 K＋激活的对硝基苯酚磷酸酯酶活性测定实验63

支持方案3 5′-核苷酸酶活性测定实验64

支持方案4间接免疫荧光法检测与质膜片层相连的蛋白质65

单元3.3 利用差速及密度梯度离心法从组织和细胞中分离Go1gi膜66

基本方案1利用蔗糖密度筛从大鼠肝脏中快速分离Golgi膜67

基本方案2将大鼠肝脏提取的轻线粒体组分悬浮于非连续的蔗糖梯度液中来分离Golgi膜68

基本方案3将培养的细胞悬浮于非连续的蔗糖梯度液中来分离Golgi膜69

基本方案4用自发形成梯度的IODIXANOL梯度液从肝细胞微粒体组分中分离Golgi膜70

支持方案测定UDP-半乳糖半乳糖基转移酶71

单元3.4 利用差速离心及密度梯度离心从组织及细胞中分离溶酶体72

基本方案1使用自发形成梯度的PERCOLL梯度液从大鼠肝脏中分离溶酶体72

基本方案2 利用自发形成梯度的PERCOLL梯度液从培养的人HL-60细胞中分离溶酶体74

支持方案1酸性磷酸酶的测定75

支持方案2 β-N-乙酰葡糖胺酶的测定76

单元3.5 差速离心法从组织和细胞中分离线粒体76

基本方案1用大鼠肝脏制备重线粒体组分77

基本方案2牛心脏线粒体的大量制备78

基本方案3用骨骼肌制备线粒体79

基本方案4用培养的细胞制备线粒体80

基本方案5用酵母菌（酿酒酵母）制备线粒体80

单元3.6 密度梯度离心法纯化粗线粒体组分81

基本方案1用连续蔗糖梯度液分离大鼠肝脏的线粒体组分82

基本方案2用非连续PERCOLL梯度液从大鼠脑分离线粒体83

基本方案3用自发形成梯度的PERCOLL梯度液分离线粒体组分84

支持方案1线粒体的琥珀酸脱氢酶分析84

支持方案2溶酶体的β-半乳糖苷酶分析85

支持方案3过氧化物体的过氧化氢酶分析86

单元3.7 用差速离心法和密度梯度离心法从组织和细胞中分离过氧化物体86

基本方案1从大鼠肝脏分离轻线粒体组分87

基本方案2 用预先形成的连续IODIXANOL梯度液分离大鼠肝脏轻线粒体组分中的过氧化物体88

基本方案3用预先形成的连续NYCODENZ梯度液分离大鼠肝脏轻线粒体组分中的过氧化物体89

基本方案4用预先形成的连续NYCODENZ梯度液从酵母原生质体分离过氧化物体90

基本方案5用预先形成的连续NYCODENZ梯度液从培养细胞（HepG2）分离过氧化物体91

支持方案内质网标志酶NADPH细胞色素c还原酶的分析92

单元3.8 从哺乳动物组织中分离细胞核及核膜93

基本方案1使用蔗糖密度筛从大鼠肝组织匀浆中分离细胞核93

备择方案 使用IODIXANOL梯度液从动物或植物（麦芽）细胞中分离细胞核94

基本方案2分离细胞核膜：高离子强度的方法95

基本方案3分离细胞核膜：低离子强度的方法96

支持方案1二苯胺检测DNA97

支持方案2苔黑素测定RNA97

支持方案3溴化乙锭测定RNA及DNA98

单元3.9 酿酒酵母的亚细胞组分分离99

基本方案1利用差速离心法分离原生质体组分111

支持方案应用酶解酶制备酵母原生质体113

基本方案2应用NYCODENZ进行平衡密度梯度组分分离114

基本方案3在蔗糖分级梯度液中进行P13000膜的组分分离116

基本方案4应用FICOLL分级梯度液分离完整的囊泡118

基本方案5应用F1COLL分级梯度液分离完整的细胞核120

基本方案6应用NYCODENZ分级梯度液分离乳糖诱导的线粒体124

基本方案7用蔗糖分级梯度液分离油酸盐诱导的过氧化物酶体127

基本方案8用蔗糖分级梯度液分离内质网129

基本方案9用蔗糖分级梯度液从完整的酵母细胞中分离质膜131

基本方案10从完整的酵母细胞中分离细胞溶胶132

第4章 细胞生物学研究的工具——抗体135

单元4.1 单克隆抗体的制备136

基本方案1制备单克隆抗体的免疫方法136

基本方案2细胞融合与杂交瘤细胞的选择137

支持方案1筛选原始杂交瘤上清140

支持方案2杂交瘤细胞系的建立140

支持方案3用有限稀释法进行克隆化培养141

支持方案4制备克隆化／扩增培养基142

单元4.2 多克隆抗体的制备142

基本方案用弗式佐剂免疫产生多克隆抗体142

备择方案用其他佐剂免疫产生多克隆抗血清144

支持方案血清的制备145

单元4.3 免疫球蛋白G的纯化145

基本方案1硫酸铵沉淀和分子筛层析145

基本方案2蛋白A葡聚糖亲和层析146

备择方案1蛋白G葡聚糖亲和层析148

备择方案2抗大鼠κ链单克隆抗体结合的葡聚糖亲和层析148

基本方案3以Tris·Cl为缓冲液的DE52离子交换层析149

单元4.4 抗体缀合物用于细胞生物学研究150

基本方案抗体与荧光团或生物素的结合150

支持方案估计抗体浓度的方法155

第5章 显微镜术156

单元5.1 光学显微镜的校准及调节157

光学显微镜的主要部件158

亮视场与荧光显微镜术成像及Kohler照明光路的基础知识162

基本方案1亮视场，透射显微镜术的Kohler照明校准164

基本方案2目镜的校准166

基本方案3表面荧光显微镜Kohler照明模式的校准166

基本方案4相差显微镜术的校准167

支持方案显微镜光学部件的维护及清洗169

单元5.2 荧光显微镜术170

荧光显微镜光学系统170

荧光显微镜部件171

数字化暗室174

单元5.3 免疫荧光染色175

基本方案培养细胞的免疫荧光标记175

单元5.4 荧光染料及荧光脂类衍生物标记细胞器177

基本方案1固定细胞的内质网染色179

备择方案活细胞内内质网染色180

基本方案2活细胞内高尔基复合体染色180

基本方案3线粒体染色182

单元5.5 基本共聚焦显微镜术183

光切基础183

共聚焦显微镜的类型184

应用指南187

单元5.6 用免疫过氧化物酶方法定位培养细胞和组织的抗原191

计划策略192

基本方案1培养细胞的免疫过氧化物酶染色192

基本方案2组织的免疫过氧化物酶染色194

单元5.7 低温免疫金电子显微镜技术196

基本方案免疫金标记197

支持方案1用免疫金标记方法固定细胞198

支持方案2用免疫金标记方法固定组织198

支持方案3免疫金标记方法做冰冻切片199

支持方案4 经碳-聚乙烯醇缩甲醛和氯乙聚乙烯醇三元共聚物处理的铜栅格的准备200

单元5.8 相关的视频光学／电子显微镜术201

基本方案相关的视频光学／电子显微镜术201

单元5.9 活细胞内微管和肌动蛋白丝的荧光斑点显微镜技术（FSM）205

计划策略205

基本方案1设计一个时延数字化FSM显微镜系统206

基本方案2活细胞内细胞骨架的时延FSM成像210

基本方案3时延FSM系列影像的定性和定量分析212

支持方案1 FSM荧光标记的微管蛋白的制备213

支持方案2 FSM荧光标记肌动蛋白的制备216

单元5.10 作为活细胞影像工具的GFP219

制备融合蛋白219

第6章 细胞蛋白质的特性225

单元6.1 膜结合蛋白质的分析226

基本方案1碱性碳酸盐提取226

备择方案1尿素提取227

备择方案2高盐提取227

备择方案3 Triton X-114相位分离227

支持方案Triton X-114预浓缩228

基本方案2磷脂酰肌醇磷脂酶（PI-PLC）水解GPI结合蛋白228

基本方案3 Triton X-100对不溶性整合膜蛋白和GPI结合蛋白的增溶作用229

单元6.2 蔗糖密度梯度区带沉淀法测定分子质量230

基本方案1利用梯度自动形成仪制备蔗糖梯度的区带离心231

备择方案1用简易梯度形成仪制备蔗糖梯度的区带离心232

支持方案1普通分子质量标志物的应用和制备234

基本方案2穿刺法分部收集样品235

备择方案2管底穿刺蠕动洗脱分离法236

支持方案2沉降系数的计算236

单元6.3 体积排阻层析法（凝胶过滤）测定分子质量237

设计策略238

基本方案1体积排阻-高效液相层析（SE-HPLC）239

基本方案2常规体积排阻层析（SEC）241

第7章 电泳与免疫印迹244

单元7.1 蛋白质的单向SDS凝胶电泳246

基本方案变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法248

备择方案1 Tris-tricine缓冲液系统的电泳252

备择方案2在梯度凝胶中分离蛋白质254

单元7.2 非变性条件下的单向凝胶电泳256

基本方案非变性聚丙烯酰胺连续电泳256

备择方案 非变性不连续凝胶电泳以及分子质量标准曲线的绘制260

单元7.3 双向凝胶电泳261

基本方案1高分辨率的平衡柱凝胶等电聚焦电泳262

支持方案1 pH特性的测定264

备择方案1极端酸性蛋白的非平衡等电聚焦电泳265

备择方案2极端碱性蛋白的非平衡等电聚焦265

支持方案2细胞抽提物的等电聚焦266

基本方案2 IEF柱凝胶的第二向电泳267

支持方案3标准分子质量蛋白质的双向凝胶268

备择方案3对角线凝胶电泳（非还原／还原凝胶）269

单元7.4 蛋白质单向平板凝胶等电聚焦电泳270

基本方案变性平板凝胶等电聚焦电泳270

支持方案变性等电聚焦平板凝胶的电转印271

单元7.5 蛋白质的琼脂糖凝胶271

基本方案琼脂糖凝胶电泳和印迹的免疫检测271

单元7.6 凝胶中蛋白质的染色273

基本方案1考马斯亮蓝染色273

备择方案等电聚焦后进行考马斯亮蓝染色274

基本方案2银染法274

基本方案3蛋白质凝胶的荧光检测276

基本方案4可逆蛋白锌染法277

单元7.7 免疫印迹和免疫检测277

基本方案1用转移槽转印蛋白质278

备择方案1用半干转移系统转印蛋白质279

支持方案1转印后蛋白质的可逆染色280

基本方案2用二抗偶联物进行免疫检测281

备择方案2用亲和素-生物素偶联的二抗进行免疫检测282

基本方案3用发色（光）底物显迹282

支持方案2膜的清洗和再使用283

单元7.8 凝胶和印迹中放射性标记蛋白的检测和量化283

基本方案放射性自显影283

支持方案1固定和干燥用于放射自显影的凝胶285

支持方案2强化屏的使用286

备择方案1荧光显影286

支持方案3光密度计量287

备择方案2磷光成像287

第8章 蛋白标记和免疫沉淀289

单元8.1 用放射性标记的氨基酸进行代谢性标记290

使用35S标记的化合物的安全预防措施291

基本方案35S甲硫氨酸脉冲标记悬浮细胞291

备择方案1 35S甲硫氨酸脉冲标记贴壁细胞292

备择方案2 35S甲硫氨酸脉冲-追踪标记细胞293

备择方案3 35S甲硫氨酸长期标记细胞293

备择方案4用其他放射性标记氨基酸进行的代谢性标记294

支持方案TCA沉淀确定标记物的结合量294

单元8.2 用放射性标记的糖代谢性标记糖蛋白295

基本方案用放射性标记的糖进行脉冲-追踪标记296

备择方案用放射标记的糖进行的长期标记297

单元8.3 用放射标记的脂肪酸进行的代谢性标记298

基本方案用脂肪酸进行的生物合成标记298

单元8.4 细胞蛋白质的放射性碘化299

使用125I标记化合物的安全性预防措施300

基本方案1应用乳糖过氧化物酶对细胞表面进行125I标记300

基本方案2去垢剂溶解的膜蛋白的碘化301

支持方案通过均质化进行膜的制备302

基本方案3乳糖过氧化物酶催化的可溶性蛋白的碘化302

单元8.5 免疫沉淀304

基本方案1应用非变性去垢剂裂解悬浮细胞的免疫沉淀304

备择方案1非变性去垢剂溶液裂解贴壁细胞的免疫沉淀307

备择方案2变性条件下去垢剂裂解细胞进行的免疫沉淀308

备择方案3非去垢剂裂解的细胞免疫沉淀308

基本方案2免疫沉淀-回收308

单元8.6 酵母蛋白的代谢标记和免疫沉淀309

基本方案酵母蛋白的标记和免疫沉淀309

备择方案制备酵母原生质体311

第9章 蛋白质的磷酸化作用313

单元9.1 用32P标记培养细胞和制备用于免疫沉淀的细胞裂解物314

基本方案 用32P标记的培养细胞和使用温和的去垢剂裂解细胞314

备择方案在SDS中煮沸裂解细胞315

单元9.2 磷酸化的免疫检测316

基本方案1应用免疫印迹技术对蛋白质磷酸化的免疫测定316

基本方案2 由免疫印迹产生的免疫沉淀物来免疫监测蛋白质的磷酸化作用319

基本方案3组织培养细胞的荧光免疫染色320

单元9.3 MAP蛋白激酶信号的检测321

基本方案1通过免疫沉淀反应测定MAP激酶（ERK）的活性322

基本方案2凝胶内激酶测定324

基本方案3 JNK测试325

支持方案GST-JUN-谷胱甘肽珠子的准备326

第10章 蛋白质转运328

单元10.1 用糖苷酶研究蛋白质转运329

基本方案1内切糖苷酶H消化329

基本方案2肽：N-糖苷酶F消化330

基本方案3唾液酸酶（神经氨酸苷酶）消化331

基本方案4 α内切-N-乙酰氨基半乳糖苷酶332

单元10.2 内吞作用333

基本方案1测量转铁蛋白受体在表面和内部间的稳态分布333

基本方案2测量转铁蛋白内化作用动力学334

备择方案1采用125I标记抗体测量膜蛋白内化作用动力学335

备择方案2测量悬浮生长细胞的转铁蛋白内化作用动力学336

基本方案3测量转铁蛋白受体再循环的动力学337

支持方案1带金属离子的转铁蛋白338

支持方案2二铁转铁蛋白的放射性标记338

基本方案4测量液相摄取339

支持方案3通过撤除钾离子来抑制网格蛋白介导的内吞作用340

支持方案4通过胞质酸化来抑制网格蛋白介导的内吞作用340

单元10.3 蛋白质转运到质膜341

基本方案采用唾液酸酶消化测定到达细胞表面341

备择方案 通过细胞表面分子的生物素化来测量到达细胞表面342

单元10.4 极化上皮细胞中的膜转运343

基本方案1转染极化上皮细胞悬液和选择抗性克隆344

支持方案1挑取稳定转染的克隆345

支持方案2在滤器上培养上皮细胞345

支持方案3测量生长在滤器上的单层细胞的泄漏347

基本方案2极化上皮细胞中的脉冲-追踪实验347

基本方案3新合成上皮细胞表面蛋白的生物素化348

基本方案4极化上皮细胞蛋白的间接免疫荧光分析349

第11章 细胞增殖，细胞衰老和细胞死亡351

单元11.1 用流式细胞术确定细胞周期阶段352

基本方案1用碘化丙啶染色的固定化细胞的细胞周期分析353

备择方案1用DAPI染色的固定细胞的细胞周期分析355

基本方案2用PI染色的非固定、去垢剂渗透细胞的细胞周期分析355

备择方案2用DAPI染色的非固定、去垢剂渗透细胞的细胞周期分析356

基本方案3活细胞用Hoechst 33342进行染色356

基本方案4DNA含量和Cyclins D、E、A或B1的二元分析356

单元11.2 在细胞周期的特定时期细胞同步化的方法358

基本方案1采用有丝分裂震脱富集有丝分裂细胞358

备择方案1预富集指数生长培养物用于分离有丝分裂细胞359

备择方案2通过诺考达唑阻滞富集有丝分裂细胞359

基本方案2通过血清饥饿富集G0/G1细胞359

备择方案3通过氨基酸饥饿富集G0/G1细胞360

基本方案3用洛伐他汀富集G1期细胞360

备择方案4用含羞草碱阻滞富集G1期细胞361

基本方案4通过双重胸苷阻滞使细胞在S期起始处达到同步化361

备择方案5进行连续的G1/S阻滞362

支持方案1测定有丝分裂指数363

支持方案2通过TCA沉淀监测3H胸苷掺入DNA364

单元11.3 分析细胞周期中CDK活性和DNA复制365

基本方案1测量CDK活性365

基本方案2用BrdU掺入测量DNA复制368

单元11.4 通过DNA片段化和形态学标准评价凋亡和坏死370

基本方案1台盼蓝排斥测量细胞死亡371

基本方案2细胞的差异染色371

基本方案3细胞的Hoechst染色372

支持方案Cytospin制备用于分析的细胞373

基本方案4细胞DNA片段化的TUNEL分析373

备择方案1石蜡包埋切片的TUNEL分析374

基本方案5整个细胞DNA片段化的检测375

备择方案2总基因组DNA的DNA片段化检测376

备择方案3检测DNA片段化的简单方案377

备择方案4用于琼脂糖凝胶电泳的DNA片段的酚抽提378

基本方案6 DNA片段的定量分析379

基本方案7用脉冲场琼脂糖凝胶电泳检测高分子质量染色质片段380

单元11.5 细胞凋亡期间Caspase活化分析382

基本方案1 Caspase活性的酶促分析382

基本方案2用免疫印迹检测Caspase活性384

备择方案1盐酸胍裂解细胞用于免疫印迹385

支持方案1从印迹上去除（剥离）第一抗体和第二抗体386

基本方案3用生物素化底物类似物标记和检测活化的Caspases386

备择方案2用亲和标记测量天然裂解液中的Caspase体外活化387

支持方案2亲和标记活化Caspase特异性控制388

支持方案3 d-生物素存在时将膜剥离用于抗体再次杂交388

第12章 体外重建390

单元12.1 体外翻译392

基本方案1 制备和使用依赖mRNA的兔网织红细胞无细胞翻译体系392

基本方案2依赖mRNA的麦胚无细胞翻译体系的制备和使用394

基本方案3利用协同转录／翻译体系进行体外蛋白质合成396

支持方案1无帽体外转录物的制备397

支持方案2带帽体外转录物的制备398

备择方案用生物素连接的氨基酸进行体外翻译399

支持方案3用链霉亲和素-琼脂糖捕获生物素连接的蛋白质400

单元12.2 蛋白质共翻译转运进入犬粗面微粒体401

基本方案向犬粗面微粒体的转运401

支持方案1从犬胰腺制备RM402

支持方案2制备EDTA剥离的粗面微粒体404

支持方案3柱洗脱粗面微粒体的制备404

单元12.3 体外分析哺乳动物细胞中内质网到高尔基体的物质运输405

基本方案1用半完整细胞重建内质网到高尔基体的运输405

备择方案 用半完整细胞重建内质网到高尔基体顺面区域的运输408

基本方案2用哺乳动物细胞微粒体体外重建内质网到高尔基体的运输408

基本方案3内质网膜泡的体外形成和分离409

支持方案1 NRK细胞微粒体膜的制备411

支持方案2 VSV ts045病毒的繁殖412

基本方案4内质网囊泡与高尔基体膜的融合412

支持方案3制备大鼠肝细胞细胞液414

支持方案4从大鼠肝细胞制备高尔基体膜414

单元12.4 用洋地黄皂苷透化细胞进行核物质输入416

基本方案贴壁型HeLa细胞中的核物质输入416

支持方案1制备非洲爪蟾卵细胞细胞液417

支持方案2制备荧光标记的核输入性底物TRITC-BSA-NLS419

支持方案3 制备荧光标记的重组核输入性底物GFP-GST-NLS420

单元12.5 非洲爪蟾间期卵提取物的制备和使用422

基本方案1制备分裂间期卵提取物422

备择方案1制备间期细胞的分级分离提取物424

支持方案1用注射方法获得非洲爪蟾卵细胞424

基本方案2用分裂间期卵细胞提取物进行核组装425

支持方案2制备去膜精子染色质作为核组装模板426

基本方案3体外进行核蛋白输入429

基本方案4用连续标记DNA方法分析复制过程430

备择方案2用脉冲标记DNA方法分析复制过程431

基本方案5制备卵母细胞提取物431

支持方案3免疫去除方法去除提取物蛋白质433

支持方案4向提取物中加入目的蛋白434

单元12.6 利用非洲爪蟾卵细胞提取物分析细胞周期434

基本方案1制备细胞周期提取物434

基本方案2制备被CSF抑制的提取物436

基本方案3制备有丝分裂提取物438

基本方案4使间期提取物进入有丝分裂438

备择方案在体外生成复制检验点439

支持方案1监测提取物的细胞周期状态440

支持方案2检测组蛋白H1激酶活性440

支持方案3使被CSF抑制的提取物进入间期441

单元12.7 有丝分裂纺锤体的体外组装442

基本方案1分析DMSO和中心体的星体反应442

基本方案2分析精子DNA“半纺锤体”反应443

基本方案3分析精子DNA周期性反应444

基本方案4分析DNA磁珠反应445

支持方案1制备CSF提取物446

支持方案2制备罗丹明标记微管蛋白447

支持方案3马达蛋白的破坏448

支持方案4甩片反应449

支持方案5制备DNA包被磁珠451

单元12.8 利用非洲爪蟾卵提取物研究细胞凋亡452

基本方案 制备凋亡提取物并检测凋亡过程452

备择方案 将凋亡分成潜伏时相和执行时相453

支持方案1检测Caspase3样活性454

支持方案2利用爪蟾卵提取物制备线粒体454

支持方案3检测细胞色素c的释放455

支持方案4用纯化的线粒体和细胞质检测细胞色素c的释放455

单元12.9 体外转录456

基本方案利用核提取物进行体外转录反应456

支持方案1用HeLa细胞制备核提取物457

支持方案2制备高盐果蝇核提取物459

支持方案3从分离出的果蝇胚胎核制备可溶性核组分462

支持方案4体外转录产物的引物延伸分析462

第13章 细胞黏附与细胞外基质465

单元13.1 细胞-底物黏附试验467

基本方案1伸展试验468

基本方案2附着试验469

支持方案制备肽-蛋白结合物471

单元13.2 利用离心力定量测定细胞黏附能力471

基本方案离心细胞黏附试验472

单元13.3 依赖钙黏素的细胞-细胞黏附474

研究策略474

基本方案1短期聚集培养474

备择方案长期聚集培养476

基本方案2混合细胞聚集培养477

支持方案1以TC处理成纤维细胞使细胞解离478

支持方案2以TC处理胚胎细胞使细胞解离478

支持方案3 以LTE或TE处理细胞使细胞解离479

基本方案3检测钙黏素和连环蛋白480

基本方案4抑制钙黏素的功能481

基本方案5在钙黏素缺乏或连环蛋白缺陷的细胞系中，恢复钙黏素的活性482

单元13.4 分析整合素依赖性黏附482

基本方案1在基于细胞的试验中分析整合素依赖性黏附482

基本方案2固相分析整合素-配体相互作用484

支持方案1整合素的纯化486

支持方案2抗体与Sepharose的交联488

支持方案3用生物素标记整合素配体490

单元13.5 分析由免疫球蛋白超家族细胞黏附分子所介导的细胞-细胞联系490

基本方案1通过免疫亲和层析技术纯化IgSF-CAM490

支持方案1制备亲和层析柱491

支持方案2溶解膜蛋白492

基本方案2利用荧光微球分析蛋白质的相互作用493

支持方案3将蛋白质与荧光微球相交联494

基本方案3蛋白微球与培养细胞的结合495

基本方案4用骨髓瘤细胞作交互作用试验496

支持方案4用原生质体融合方法对骨髓瘤细胞进行稳定转染497

基本方案5神经突外长试验500

基本方案6在体外抑制CAM-CAM相互作用500

支持方案5用IgSF-CAM包被细胞培养皿501

支持方案6硝酸纤维素预先包被玻璃表面502

单元13.6 纤连蛋白的纯化502

基本方案1纯化血浆纤连蛋白502

基本方案2从培养细胞中纯化纤连蛋白504

备择方案1亲和纯化提取的细胞纤连蛋白505

备择方案2从条件培养基中纯化人细胞纤连蛋白505

单元13.7 玻连蛋白的纯化507

基本方案507

单元13.8 制备胶冻状的基质509

基本方案1制备Ⅰ型胶原基质509

基本方案2制备Matrigel基质510

备择方案1在Matrigel基质中培养细胞510

备择方案2在体内使用Matrigel基质做血管发生检验和肿瘤生长试验511

单元13.9 制备培养的角膜内皮细胞和PF-HR9内胚层细胞分泌的细胞外基质512

基本方案制备牛角膜内皮细胞胞外基质（BCE-ECM）512

备择方案制备HR9-ECM514

支持方案1细胞增殖检验515

支持方案2细胞分化检验515

单元13.10 制备培养的成纤维细胞产生的细胞外基质516

基本方案制备培养的成纤维细胞产生的细胞外基质516

支持方案1细胞附着检测517

支持方案2确定细胞的形状518

支持方案3成纤维细胞来源的三维基质的机械压缩520

支持方案4成纤维细胞来源的三维结构基质的溶解521

单元13.11 蛋白聚糖的分离和分析522

基本方案1从培养细胞分离蛋白聚糖522

备择方案分离蛋白聚糖库523

支持方案35SO4或3H葡萄糖胺标记蛋白聚糖523

基本方案2二乙氨乙基-葡聚糖纤维素进行蛋白聚糖的阴离子交换层析纯化524

基本方案3按大小排阻的层析法分析蛋白聚糖524

基本方案4碱性消除法分析葡聚糖胺的大小525

基本方案5用木瓜蛋白酶消化法分析葡聚糖胺的分子质量526

基本方案6用裂解酶降解葡聚糖胺，分析葡聚糖胺的含量和蛋白核心526

基本方案7用硝酸处理法降解硫酸乙酰肝素527

基本方案8分析葡聚糖胺的类型和核心蛋白527

基本方案9分析葡聚糖胺的大小528

基本方案10蛋白聚糖的免疫沉淀528

单元13.12 基质金属蛋白酶529

基本方案1活细胞的胶原纤维的溶解和降解529

支持方案制备大鼠尾腱Ⅰ型胶原530

基本方案2白明胶／干酪素酶水解图谱分析532

基本方案3反向酶水解图谱分析533

第14章 细胞的能动性535

单元14.1 真核细胞趋化实验535

策略设计535

基本方案1滤膜趋化实验536

支持方案1计算无化学吸引剂时细胞迁入厚滤膜的大约距离538

基本方案2琼脂糖下趋化实验539

基本方案3少量细胞趋化实验540

基本方案4桥趋化实验541

基本方案5吸管趋化实验542

单元14.2 侵袭实验543

基本方案测量经基质的侵袭543

支持方案准备涂布Matrigel的滤膜544

单元14.3 细胞牵引力545

基本方案1检测细胞在起皱底物上的牵引力545

支持方案1校准微型针546

备择方案1用另一种聚合物检测细胞在起皱底物上的牵引力547

备择方案2检测细胞在无皱褶底物上的牵引力547

支持方案2制备改装的喷枪548

基本方案2测量在微机械制造的底物上的细胞牵引力549

支持方案3硅烷化盖玻片552

支持方案4制备偏光反射立方体552

单元14.4 细胞损伤实验553

策略设计553

基本方案用荧光素右旋糖酐检测培养单层细胞的损伤554

备择方案1用荧光素右旋糖酐检测哺乳动物组织的损伤555

备择方案2以白蛋白作为损伤示踪剂检测细胞损伤557

单元14.5 盘基网柄菌属细胞动力学558

基本方案1观察单个活细胞内GFP标记的蛋白质558

备择方案1普遍加入化学吸引剂后的GFP标记蛋白的图像记录559

备择方案2化学吸引剂梯度作用下的GFP标记蛋白的图像记录560

基本方案2聚集细胞群和损伤细胞的GFP标记蛋白的图像记录561

支持方案1质粒构建和转化561

支持方案2细胞在无营养琼脂上发育的表型筛选563

第15章 细胞器运动564

单元15.1 微管／细胞器运动实验564

基本方案微管／细胞器运动实验564

支持方案1简单灌流室和盖玻片的制备567

支持方案2海胆精子轴丝的制备568

支持方案3猪脑微管蛋白的制备569

支持方案4大鼠肝细胞溶胶的制备573

支持方案5大鼠肝细胞器组分的制备573

单元15.2 肌动蛋白通过肌球蛋白移动的体外运动实验575

基本方案分析肌动蛋白通过肌球蛋白的移动575

支持方案1灌流室的制备577

支持方案2肌动蛋白的纯化578

支持方案3罗丹明鬼笔环肽标记的肌动蛋白的制备579

单元15.3 植物细胞的细胞器运动：通过绿色荧光蛋白（GFP）使高尔基复合体和内质网的运动成像580

基本方案瞬时表达在树叶内质网和高尔基探针可视化方面的应用580

单元15.4 细胞核运动582

基本方案细胞核运动实验582

支持方案1从淋巴细胞分离中心体585

支持方案2浓缩中心体的滴定587

支持方案3制备用于细胞核组装的分裂间期提取物588

支持方案4高速上清液（HSS）的制备591

支持方案5以DNA包被磁珠作为模板组装细胞核591

附录593

附录1 试剂与溶液593

附录2 实用信息和数据709

2A 实用测量值和数据709

2B 细胞生物学研究中常用的药物概要710

2C 放射性同位素的数据734

2D 常见荧光的最大吸收和激发波长738

2E 离心机及转子743

附录3 常用技术750

3A 分光光度计测量蛋白质浓度750

3B 比色法检测和定量总蛋白753

3C 蛋白质溶液的透析和浓缩766

3D 用吸收和荧光光谱学定量DNA和RNA769

3E DNA的PCR酶促扩增：标准程序和优化772

3F 微量RT-PCR778

附录4 试剂和仪器设备供应商选录781

参考文献827

索引835