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第一篇 鱼类养殖疾病与疫苗沿革3

第一章 养殖海水鱼类的疾病3

第一节 养殖海水鱼病毒病3

一、弹状病毒病3

二、淋巴囊肿病4

三、双RNA病毒病4

四、病毒性神经坏死病4

五、病毒性红细胞坏死病5

六、虹彩病毒感染症5

七、疱疹病毒病5

八、传染性胰脏坏死病毒病5

九、传染性造血器官坏死病毒病6

十、口白症6

十一、传染性脾肾坏死病毒病6

十二、水生呼肠孤病毒病7

十三、病毒性腹水病7

十四、病毒性畸形病7

十五、红细胞包涵体综合征7

十六、细胞肿大病毒病8

第二节 养殖鱼类细菌病和其他疾病9

一、细菌性疾病9

二、低等藻类所致疾病11

三、原虫病12

四、蠕虫病14

五、甲壳动物病14

六、其他疾病15

第三节 我国牙鲆养殖状况与主要疾病15

一、牙鲆养殖状况15

二、牙鲆常见疾病16

第四节 淋巴囊肿病及其研究现状19

一、淋巴囊肿病病毒的纯化和体外培养19

二、病理学研究19

三、病毒结构和基因组研究21

四、病毒结构蛋白与抗原性研究22

五、LCDV的致病机制23

六、患淋巴囊肿病牙鲆的抗体检测24

七、诊断与防治研究24

八、病毒多样性与基因组学研究现状26

第五节 水产动物疾病早期诊断技术27

一、免疫学诊断技术27

二、分子生物学诊断技术31

参考文献32

第二章 鱼类疫苗研究史与病毒核酸疫苗37

第一节 鱼类疫苗研究史37

一、抗细菌疫苗37

二、抗病毒疫苗38

三、鱼类疫苗接种研究39

第二节 核酸疫苗40

一、核酸疫苗简介40

二、核酸疫苗的优点41

三、核酸疫苗的构成42

四、核酸疫苗的免疫机制42

五、提高核酸疫苗免疫效果的优化策略43

六、“自杀性”疫苗及其研究进展44

七、菌蜕疫苗研究进展46

第三节 鱼用核酸疫苗研究概况与研制技术47

一、研究概况47

二、研制技术51

第四节 影响核酸疫苗诱导水平和免疫效果的因素52

一、核酸疫苗诱导的体液免疫52

二、核酸疫苗诱导的细胞免疫52

三、核酸疫苗的免疫机制53

四、影响核酸疫苗免疫效果的因素54

第五节 核酸疫苗的安全性及相关问题55

一、基因整合56

二、生殖毒性57

三、免疫耐受57

四、自身免疫疾病58

五、疫苗生产菌株所带来的安全问题59

六、对环境和消费者的安全问题60

七、结语60

第六节 核酸疫苗佐剂的研究进展61

一、脂质体核酸疫苗佐剂的研究进展61

二、细胞因子、CpG ODN等佐剂的研究进展64

第七节 核酸疫苗接种途径的研究69

一、制备胶囊疫苗技术70

二、微胶囊疫苗的释放71

三、微胶囊的主要优点和作用机制72

第八节 核酸疫苗中试产品的质量控制72

一、原材料的质量控制73

二、培养过程的质量控制74

三、纯化过程中的质量控制74

四、最终产品的质量控制75

第九节 鱼用核酸疫苗研究展望76

参考文献77

第二篇 淋巴囊肿病特征、早期诊断与基因组分析87

第三章 牙鲆淋巴囊肿病流行病学与病毒分子特征87

第一节 牙鲆淋巴囊肿病流行病学特点87

第二节 淋巴囊肿病的病理学特征89

一、材料与方法89

二、结果89

第三节 淋巴囊肿病病毒的纯化94

一、剥除肿瘤外膜-超速蔗糖密度梯度离心95

二、胶原酶法分离淋巴囊肿病病毒96

第四节 淋巴囊肿病病毒的体外细胞培养102

一、材料与方法102

二、结果103

三、讨论103

第五节 淋巴囊肿病的病原学研究105

一、材料与方法105

二、结果与讨论106

第六节 患淋巴囊肿病牙鲆血清的免疫球蛋白分析107

一、材料与方法107

二、结果与讨论109

第七节 淋巴囊肿病病毒单克隆抗体制备112

一、材料与方法112

二、结果与讨论115

本章小结116

参考文献117

第四章 淋巴囊肿病早期诊断技术120

第一节 淋巴囊肿病病毒的PCR诊断方法120

一、试验材料120

二、试验方法120

三、结果与分析122

第二节LCDV-cn的定量PCR检测124

一、材料与方法124

二、结果126

三、讨论129

第三节 淋巴囊肿病核酸探针-原位杂交诊断技术129

一、试验材料129

二、试验方法130

三、结果与讨论131

第四节LCDV-cn核酸探针-点杂交检测试剂盒研制与效果135

一、材料与方法135

二、结果139

三、讨论141

参考文献141

第五章 不同虹彩病毒株系统进化关系与基因型分析145

第一节 军曹鱼淋巴囊肿病病毒mcp基因与序列分析145

一、材料与方法145

二、结果与讨论146

第二节 淋巴囊肿病病毒的遗传多样性和基因型分析147

一、试剂、仪器和材料148

二、实验方法149

三、结果150

四、讨论152

参考文献154

第六章LCDV-cn基因组信息分析156

第一节LCDV-cn和淋巴囊肿病病毒特有功能基因研究156

一、试剂与材料156

二、试验方法156

三、结果158

四、讨论和结论171

第二节LCDV-cn锌指蛋白基因的原核表达、序列同源性及编码蛋白结构分析173

一、材料174

二、方法174

三、结果176

四、讨论179

参考文献180

第七章 牙鲆淋巴囊肿病自愈过程和机制研究182

第一节 患淋巴囊肿病牙鲆与自愈牙鲆的病理学特征比较182

一、材料183

二、实验操作183

三、结果184

四、讨论185

第二节 细胞因子在牙鲆淋巴囊肿病自愈过程中的表达187

一、材料和方法188

二、结果与分析190

三、讨论194

第三节 水温对牙鲆体内MHC及TCR表达的影响196

一、材料和方法197

二、实验结果197

三、讨论199

第四节 牙鲆淋巴囊肿病血清蛋白质组研究201

一、材料201

二、实验方法201

三、结果与分析203

四、讨论206

参考文献208

第八章 牙鲆p53肿瘤抑制基因与淋巴囊肿病的关系研究211

第一节 牙鲆p53基因cDNA克隆与组织表达211

一、材料和方法212

二、结果216

三、讨论220

第二节 牙鲆p53基因组结构分析221

一、材料222

二、方法222

三、结果223

四、讨论229

第三节 牙鲆p53基因多态性及与淋巴囊肿病感染的关系229

一、材料230

二、方法230

三、结果233

四、讨论237

参考文献238

第九章RNA干扰技术在淋巴囊肿病防治中的初步应用241

第一节RNAi技术及其在海洋生物研究中的应用241

一、RNAi技术在海洋生物基因功能研究中的应用241

二、RNAi技术在海洋生物抗病毒研究中的应用242

三、RNAi技术的应用前景243

第二节RNAi对LCDV-cn在牙鲆体内复制的影响244

一、材料和方法244

二、结果247

三、讨论248

参考文献249

第三篇 淋巴囊肿病核酸疫苗的研发253

第十章 淋巴囊肿病核酸疫苗的基因克隆制备技术253

第一节LCDV-cn保护性抗原基因筛选及含MCP0.6 kb重组质粒的构建与鉴定253

一、材料254

二、方法254

三、结果257

四、讨论259

第二节LCDV-cn真核载体的构建、鉴定与表达260

一、材料与方法260

二、结果261

三、讨论264

参考文献265

第十一章 注射型核酸疫苗重组质粒的免疫效果研究266

第一节 重组质粒在牙鲆体内的存留与表达266

一、材料和方法267

二、结果270

三、讨论273

第二节 重组质粒的免疫效果评价274

一、接种淋巴囊肿病病毒核酸疫苗前后牙鲆体内LCDV-cn的检验274

二、淋巴囊肿病病毒核酸疫苗不同接种途径和剂量的免疫效果比较276

第三节 淋巴囊肿病病毒核酸疫苗的大量制备和田间试验281

一、材料与方法281

二、结果283

三、讨论285

第四节 牙鲆接种疫苗后免疫相关基因的表达286

一、材料与方法287

二、结果290

三、讨论292

参考文献294

第十二章 核酸疫苗佐剂筛选297

第一节 脂质体对核酸疫苗免疫活性的影响297

一、材料和方法297

二、结果299

三、讨论301

第二节CpG ODN对牙鲆淋巴囊肿病病毒核酸疫苗免疫活性的影响302

一、材料与方法302

二、结果304

三、讨论305

参考文献307

第十三章 核酸疫苗的安全性研究308

第一节 实验室安全性研究308

一、菌株DH5αLCDV-cn的质粒遗传稳定性研究308

二、DH5αLCDV-cn中目的基因MCP0.6kb表达稳定性310

三、制品对动物的安全性研究313

第二节 中间试验阶段安全性研究322

一、核酸疫苗质粒DNA在牙鲆注射部位存留和体内相关组织中的分布322

二、核酸疫苗质粒DNA在牙鲆血液中的存在及持续时间324

三、重组质粒核酸疫苗与牙鲆染色体的整合性研究325

四、动物用转基因细菌的存活力研究327

五、转基因微生物制品对动物的安全性329

六、讨论330

参考文献331

第十四章 核酸疫苗的生产工艺与质量检验332

第一节 中间试制生产332

一、中间试制生产332

二、工艺流程334

三、试制产品生产检验334

四、试制过程中的不足及改进建议339

五、试制结论339

第二节 核酸疫苗制备的质量检验规程340

一、菌种、毒种340

二、疫苗制造及过程控制341

三、成品检验343

四、作用与用途343

五、用法与用量343

六、注意事项343

七、储藏344

八、规格344

第三节 牙鲆淋巴囊肿病核酸疫苗质量标准344

参考文献344

附录345

第十五章 口服型淋巴囊肿病核酸疫苗研制技术与免疫效果349

第一节LCD聚丙交酯乙二醇酸口服微囊核酸疫苗研制与免疫效果研究350

一、材料和方法350

二、结果354

三、讨论359

第二节 海藻酸盐口服微囊核酸疫苗的研制与免疫效果研究360

一、材料与方法361

二、结果与讨论363

第三节 壳聚糖口服微囊核酸疫苗研制与免疫效果369

一、材料和方法369

二、结果371

本章小结378

参考文献378